Please use this identifier to cite or link to this item: http://www.repositorio.ufop.br/handle/123456789/11744
Title: Influência de diferentes meios de cultura axênicos no crescimento, viabilidade e infectividade de Leishmania (Leishmania) infantum.
Authors: Costa, Ana Flávia Pereira
metadata.dc.contributor.advisor: Roatt, Bruno Mendes
Soares, Rodrigo Dian de Oliveira Aguiar
Keywords: Leishmania
Microbiologia - cultura e meios de cultura
Albumina
Issue Date: 2019
metadata.dc.contributor.referee: Roatt, Bruno Mendes
Duarte, Mariana Costa
Borges, William de Castro
Citation: COSTA, Ana Flávia Pereira. Influência de diferentes meios de cultura axênicos no crescimento, viabilidade e infectividade de Leishmania (Leishmania) infantum. 2019. 115 f. Dissertação (Mestrado em Ciências Biológicas) - Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Universidade Federal de Ouro Preto, Ouro Preto, 2019.
Abstract: A leishmaniose visceral (LV) é um grave problema de saúde pública e está em crescente expansão em várias regiões do mundo. É considerada a forma mais grave das leishmanioses, que se não diagnosticada ou não tratada pode levar ao óbito. Duas espécies são as responsáveis pela LV no mundo sendo a Leishmania (L.) donovani principal causadora da doença no Velho Mundo e Leishmania (L.) infantum, causadora da LV no Novo Mundo. Durante seu ciclo biológico, o parasito apresenta-se em dois principais estágios morfológicos diferentes: as promastigotas extracelulares presentes no hospedeiro invertebrado e as amastigotas intracelulares presentes no hospedeiro vertebrado. Ambas as formas morfológicas são passíveis de cultivar em condições laboratoriais em meios de cultura axênicos que, assemelham às propriedades e condições observadas no inseto. E, a partir dessa capacidade de se conseguir isolar e cultivar estes parasitos foi possível desenvolver grande parte do conhecimento sobre estes. Assim, em nosso estudo propusemos a utilização de diferentes meios de cultura (Grace’s® , LIT e Schneider’s® ) com diferentes suplementações (sem suplementação, suplementado com albumina 10% e suplementado com SFB 10%) com o objetivo de verificar se tais modificações influenciam no crescimento, morfologia, viabilidade e infectividade de parasitos afim de determinar o meio de cultura mais indicado para aplicação destes parasitos em desafios experimentais para testes de fármacos e vacinas, tanto in vitro quanto in vivo. Para isso, foram realizadas curvas de crescimento a partir de um inóculo de 1x107 formas promastigotas do gênero Leishmania infantum cepa OP46 (MCAN/BR/2008/OP46) nos diferentes meios com as distintas suplementações por 10 dias de acompanhamento. Ao analisar as curvas de crescimento dos parasitos em todos os meios de cultura com as diversas suplementações, foram observados distintos padrões no crescimento. Foi observado que os meios LIT e Schneider’s® na ausência e presença do SFB, apresentaram crescimento semelhante, e apresentaram uma grande multiplicação de parasitos. Já o meio Grace’s® suplementado com SFB e todos os meios acrescidos de albumina apresentaram crescimento mais reduzido. Em relação à morfologia, verificamos que, nos primeiros dias (1º - 4º dia) da curva de crescimento as formas promastigotas em todos os meios suplementados ou não, apresentaram-se alongadas, com flagelo livre e com intensa motilidade. No meio Grace’s® com suas três modificações e no Schneider’s® modificado ou não, aparecem formas arredondadas a partir do 5º dia. Já no meio LIT essas formas morfológicas começam a alterar entre o 5º e o 7º dia de cultivo em todas as modificações de suplementação. Em relação à viabilidade, que foi determinada por meio da citometria de fluxo, com marcação por iodeto de propídeo, pode-se constatar que no início da curva há uma alta porcentagem de promastigotas vivas em todos os meios e em todas as diferentes suplementações. Esse número começa a decair com o passar dos dias da curva de crescimento. Além disso, observamos nos meios sem suplementação grande mortalidade dos parasitos, na suplementação com albumina os parasitos parecem sobreviver por mais tempo e nos meios acrescidos de SFB a viabilidade foi variável dependente do meio. Após determinados os dias em que foi observado o maior número de promastigotas metacíclicas (fase estacionária), foram realizadas infecções in vitro em células murinas da linhagem J774.A1. Este procedimento foi realizado empregando-se duas técnicas distintas: citometria de fluxo e microscopia ótica. Utilizou-se também uma estratégia da contagem do número de amastigotas/macrófagos. Tal contagem demonstrou uma maior presença de amastigotas nos meios em que o parasito havia sido cultivado na presença de SFB. Para a citometria de fluxo, o índice de infecção foi acima de 80% para as promastigotas cultivadas no meio LIT acrescido de SFB. Na microscopia ótica, o meio LIT suplementado com albumina e SFB foram os que obtiveram taxa de infecção mais elevadas. Diante dos dados obtidos em nosso trabalho o meio de cultura LIT suplementando com SFB, serio o meio de cultura mais indicado para cultivo e utilização dos parasitos da espécie L. infantum para ensaios de infecção in vitro e in vivo.
metadata.dc.description.abstracten: Visceral leishmaniasis (VL) is a serious public health problem and is expanding in several regions of the world. It is considered the most complicated form of leishmaniasis, which if undiagnosed or untreated can lead to death. Two species are responsible for VL in the world being Leishmania (L.) donovani, the main cause of the disease in the Old World and Leishmania (L.) infantum, which causes VL in the New World. During its biological cycle, the parasite presents two main different morphological stages: the extracellular promastigotes present in the invertebrate host and the intracellular amastigotes observed in the vertebrate one. Both morphological forms can be cultivated under laboratory conditions in axenic culture media that resemble the properties and conditions observed in the hosts. Because this ability to isolate and cultivate these parasites, it was possible to develop much of the knowledge about these parasites. Thus, in our study we proposed the use of different culture media (Grace's® , LIT and Schneider's® ) with different supplements (without supplementation, supplemented with 10% albumin and supplemented with 10% FBS) in order to verify if such modifications influence in the growth, morphology, viability and infectivity of parasites and to determine the most suitable culture medium for the application of these parasites in experimental challenges for drug and vaccine tests, both in vitro and in vivo. For this, growth curves were performed from an inoculum of 1x107 promastigotes forms of the Leishmania infantum, strain OP46 (MCAN/BR/2008/OP46) in the different media with the different supplements for 10 days of follow-up. When analyzing growth curves of the parasites in all culture media with the various supplements, different growth patterns were observed. It was observed that the LIT and Schneider's® media in the absence and presence of SFB, presented similar growth with more number of parasites. The Grace's® medium with SFB supplementation and all others media plus albumin showed a lower growth. In relation to the morphology, we observed that, in the first days (1st - 4th day) of the growth curve, the promastigote forms in all media supplemented or not, were elongated, with free flagella and with intense motility. In the Grace's® medium with its three supplementation and in the Schneider's® modified or not, appear rounded forms from the 5th day. In the LIT medium, these morphological forms begin to change between the 5th and 7th day of cultivation in all the modifications supplementation made. Regarding the viability, which was determined by means of flow cytometry, with labeling by propidium iodide, it can be seen that at the beginning of the curve there is a high percentage of live promastigotes in all media and in all the different supplements. This number begins to decline with the passing of the days of the growth curve. In addition, we observed in the media without supplementation a high mortality of the parasites, in the supplementation with albumin the parasites seem to survive longer and in the supplementation with FBS the viability was variable dependent on the medium. After the days in which the highest number of metacyclic promastigotes (stationary phase) were observed, in vitro infections were carried out on murine cells of lineage J774.A1. This procedure was performed using two different techniques: flow cytometry and optical microscopy. A strategy of counting the number of amastigotes / macrophages was also used. Such counts demonstrated a greater presence of amastigotes in the media in which the parasite had been cultured in the presence of FBS. For flow cytometry, the infection rate was above 80% for the promastigotes cultured in the LIT medium supplemented with FBS. In optical microscopy, the LIT medium supplemented with albumin and FBS were the ones that obtained the highest infection rate. Considering the data obtained in our work, the LIT culture medium supplemented with SFB is the most suitable culture medium for L. infantum parasite culture and use of these parasites for in vitro and in vivo infection.
Description: Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa de Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto.
URI: http://www.repositorio.ufop.br/handle/123456789/11744
metadata.dc.rights.license: Autorização concedida ao Repositório Institucional da UFOP pelo(a) autor(a) em 19/09/2019 com as seguintes condições: disponível sob Licença Creative Commons 4.0 que permite copiar, distribuir e transmitir o trabalho desde que sejam citados o autor e o licenciante. Não permite o uso para fins comerciais nem a adaptação.
Appears in Collections:PPCBIOL - Mestrado (Dissertações)

Files in This Item:
File Description SizeFormat 
DISSERTAÇÃO_InfluênciaDiferentesMeios.pdf4,5 MBAdobe PDFView/Open


This item is licensed under a Creative Commons License Creative Commons