Influência de diferentes meios de cultura axênicos no crescimento, viabilidade e infectividade de Leishmania (Leishmania) infantum.

Abstract

A leishmaniose visceral (LV) é um grave problema de saúde pública e está em crescente expansão em várias regiões do mundo. É considerada a forma mais grave das leishmanioses, que se não diagnosticada ou não tratada pode levar ao óbito. Duas espécies são as responsáveis pela LV no mundo sendo a Leishmania (L.) donovani principal causadora da doença no Velho Mundo e Leishmania (L.) infantum, causadora da LV no Novo Mundo. Durante seu ciclo biológico, o parasito apresenta-se em dois principais estágios morfológicos diferentes: as promastigotas extracelulares presentes no hospedeiro invertebrado e as amastigotas intracelulares presentes no hospedeiro vertebrado. Ambas as formas morfológicas são passíveis de cultivar em condições laboratoriais em meios de cultura axênicos que, assemelham às propriedades e condições observadas no inseto. E, a partir dessa capacidade de se conseguir isolar e cultivar estes parasitos foi possível desenvolver grande parte do conhecimento sobre estes. Assim, em nosso estudo propusemos a utilização de diferentes meios de cultura (Grace’s® , LIT e Schneider’s® ) com diferentes suplementações (sem suplementação, suplementado com albumina 10% e suplementado com SFB 10%) com o objetivo de verificar se tais modificações influenciam no crescimento, morfologia, viabilidade e infectividade de parasitos afim de determinar o meio de cultura mais indicado para aplicação destes parasitos em desafios experimentais para testes de fármacos e vacinas, tanto in vitro quanto in vivo. Para isso, foram realizadas curvas de crescimento a partir de um inóculo de 1x107 formas promastigotas do gênero Leishmania infantum cepa OP46 (MCAN/BR/2008/OP46) nos diferentes meios com as distintas suplementações por 10 dias de acompanhamento. Ao analisar as curvas de crescimento dos parasitos em todos os meios de cultura com as diversas suplementações, foram observados distintos padrões no crescimento. Foi observado que os meios LIT e Schneider’s® na ausência e presença do SFB, apresentaram crescimento semelhante, e apresentaram uma grande multiplicação de parasitos. Já o meio Grace’s® suplementado com SFB e todos os meios acrescidos de albumina apresentaram crescimento mais reduzido. Em relação à morfologia, verificamos que, nos primeiros dias (1º - 4º dia) da curva de crescimento as formas promastigotas em todos os meios suplementados ou não, apresentaram-se alongadas, com flagelo livre e com intensa motilidade. No meio Grace’s® com suas três modificações e no Schneider’s® modificado ou não, aparecem formas arredondadas a partir do 5º dia. Já no meio LIT essas formas morfológicas começam a alterar entre o 5º e o 7º dia de cultivo em todas as modificações de suplementação. Em relação à viabilidade, que foi determinada por meio da citometria de fluxo, com marcação por iodeto de propídeo, pode-se constatar que no início da curva há uma alta porcentagem de promastigotas vivas em todos os meios e em todas as diferentes suplementações. Esse número começa a decair com o passar dos dias da curva de crescimento. Além disso, observamos nos meios sem suplementação grande mortalidade dos parasitos, na suplementação com albumina os parasitos parecem sobreviver por mais tempo e nos meios acrescidos de SFB a viabilidade foi variável dependente do meio. Após determinados os dias em que foi observado o maior número de promastigotas metacíclicas (fase estacionária), foram realizadas infecções in vitro em células murinas da linhagem J774.A1. Este procedimento foi realizado empregando-se duas técnicas distintas: citometria de fluxo e microscopia ótica. Utilizou-se também uma estratégia da contagem do número de amastigotas/macrófagos. Tal contagem demonstrou uma maior presença de amastigotas nos meios em que o parasito havia sido cultivado na presença de SFB. Para a citometria de fluxo, o índice de infecção foi acima de 80% para as promastigotas cultivadas no meio LIT acrescido de SFB. Na microscopia ótica, o meio LIT suplementado com albumina e SFB foram os que obtiveram taxa de infecção mais elevadas. Diante dos dados obtidos em nosso trabalho o meio de cultura LIT suplementando com SFB, serio o meio de cultura mais indicado para cultivo e utilização dos parasitos da espécie L. infantum para ensaios de infecção in vitro e in vivo.