PPBIOTEC - Doutorado (Teses)
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Item Avaliação comparativa do processo auto-fermentativo e bioaumentado de diferentes amostras de bagaços de cana- de-açúcar : identificação da microbiota autóctone e produtos gerados.(2023) Souza, Isabela Morato de; Silva, Silvana de Queiroz; Gurgel, Leandro Vinícius Alves; Silva, Silvana de Queiroz; Guimarães, Valéria Monteze; Zorel, José Augusto; Brandão, Rogélio Lopes; Barreto, Elisa da SilvaO bagaço de cana-de-açúcar (BCA) é um material remanescente da indústria sucroalcooleira considerado fonte renovável, de baixo custo e rico em açúcares. A conversão desta biomassa lignocelulósica em bioprodutos é uma alternativa favorável para amenizar problemas ambientais causados pelo uso excessivo de matéria-prima de origem fóssil, além de contribuir para o conceito de biorrefinaria. Entretanto, devido à sua estrutura recalcitrante, o acesso aos açúcares do biomaterial é um desafio para microrganismos fermentadores. Assim sendo, objetivando alcançar um bioprocesso consolidado, o presente estudo investigou o potencial hidrolítico e fermentativo da microbiota autóctone do BCA bruto durante sua fermentação, bem como a prospecção dos microrganismos presentes na biomassa. Nos ensaios de fermentação foram testadas amostras de BCA de seis usinas (A, B, C, D, E e F) na concentração de 10 g/L, monitoradas por 408 h a 37oC, sob agitação. As cepas cultiváveis foram coletadas no tempo 96 h e três delas (X, Y e Z) foram selecionadas para serem inoculadas individualmente em ensaios bioaumentados. A caracterização metagenômica do consórcio microbiano foi realizada e para quantificação dos metabólitos obtidos durante a fermentação foi feita a análise da fração líquida, enquanto a fração sólida foi caracterizada a fim de determinar os teores de celulose, hemiceluloses e lignina no início e ao final do ensaio. A microbiota presente nos bagaços no início da fermentação incluiu principalmente organismos do gênero Acetobacter, ao passo que, com 96 h de ensaio houve predominância de bactérias fermentadoras, como Clostridium, Enterobacter e Ruminiclostridium. Ao final do ensaio a abundância de Ruminiclostridium foi expressiva para as amostras analisadas neste momento. Dentre as condições testadas, alcançou-se a remoção de 37% da fração de lignina, 58% de celulose e 44% de hemiceluloses na fermentação do bagaço D por sua microbiota autóctone bioaumentada por Klebsiella pneumoniae (isolado X). Os principais produtos obtidos foram ácido caproico (2,81 g/L em Dy), etanol (2,68 g/L em A), ácido acético (1,15 g/L em D), ácido isobutírico (0,97 g/L em E), metanol (0,97 g/L em A) e ácido propiônico (0,34 g/L em C). Isto demonstra o elevado potencial lignocelulolítico da microbiota autóctone do BCA por acessar e fermentar o próprio substrato, demonstrando a possibilidade de obtenção de bioprodutos de valor agregado através do bioprocesso consolidado.Item Análise de QTL e gênomica comparativa para estudar mecanismos regulatórios da H+ -ATPASE de membrana plasmática de Saccharomyces cerevisiae.(2021) Barbosa, Patrícia Gonçalves Prates; Brandão, Rogélio Lopes; Cunha, Aureliano Claret da; Cruz, Izinara Rosse da; Brandão, Rogélio Lopes; Fietto, Luciano Gomes; Mendes, Tiago Antônio de Oliveira; Andrade, Milton Hércules Guerra de; Silva, Silvana de QueirozA H+ -ATPase é uma proteína presente na membrana citoplasmática de plantas e fungos e desempenha um papel essencial na geração de um gradiente eletroquímico de prótons, importante para a captação de nutrientes e regulação do pH intracelular. A ativação da H + -ATPase da membrana citoplasmática em Saccharomyces cerevisiae induzida por glicose é supostamente atribuída a um sinal de cálcio intracelular correlacionado ao metabolismo do fosfatidilinositol. Em estudos anteriores do nosso grupo de pesquisa, foi observada diferença de fenótipo entre as cepas S. cerevisiae BY4742 arg82Δ e PJ69 arg82Δ através do teste de atividade da H + -ATPase, indicando que o fenótipo de maior ativação da H + -ATPase está relacionado a vários genes. Diante do exposto, o objetivo deste trabalho foi utilizar diferentes abordagens genômicas para identificar novos componentes da regulação induzida por glicose da H + -ATPase. Para isso, foram realizados o sequenciamento do genoma segregante agrupado, mapeamento de QTLs e análises de Bioinformática para identificar o possível motivo da diferença de fenótipo e, ou, novos componentes desta via de transdução de sinal. Uma vez identificadas as variantes na análise de mapeamento de QTL foi desenvolvido o script SNPsInQTLselection.py para identificar as bases genéticas que podem estar envolvidas com o fenótipo de maior atividade da H+ -ATPase. Após a utilização desse script foram identificadas 42 variantes em 33 genes potencialmente envolvidos com o fenótipo de interesse. Para priorização desses genes candidatos foi realizado análise de enriquecimento e interatoma que permitiram identificar 10 genes enriquecidos e envolvidos na via da telomerase e do fosfatidilinositol (STT4, PIK2, UGA2, EST1, MEC3, HEK2, TOP3, PSO2, STO1, FUR4). Cepas do background BY contendo essesrespectivos genes deletados (coleção EUROSCARF) foram utilizadas para teste de fenótipo de acidificação extracelular e sinalização de cálcio induzida por glicose. Por meio desses testes, 4 (UGA2, FUR4, EST1 e STT4) dos 10 genes enriquecidos, apresentaram o fenótipo de maior ativação da H+ -ATPase, fenótipo esse evidenciado nos testes de acidificação extracelular e sinal de cálcio. Destes 4 genes, vale destacar o STT4 visto que, de acordo com a função descrita para esse gene na literatura o fosfatidilinositol-4-fosfato pode exercer um papel na regulação da via de ativação de H + -ATPase, controlando a atividade da fosfolipase C. Tendo em vista uma relação positiva entre atividade da H + - ATPase e desempenho fermentativo, estudos futuros podem ser feitos com os genes/alelos identificados neste trabalho, com aplicação em cepas de leveduras industriais visando a melhoria na eficiência de processos fermentativos. Os genes (UGA2, FUR4, EST1 e STT4) merecem investigação detalhada para verificação do possível envolvimento na via de sinalização da H+ -ATPase. Esse trabalho apresenta pela primeira vez uma estratégia de Bioinformática para identificar genes candidatos quando o resultado do mapeamento de QTL não for significativo.Item Avaliação in silico e in vitro do efeito tripanocida de óleos essenciais e desenvolvimento de sistemas nanoestruturados como alternativa terapêutica da doença de Chagas.(2019) Seibert, Janaína Brandão; Santos, Orlando David Henrique dos; Vieira, Paula Melo de Abreu; Alexander, Cameron; Santos, Orlando David Henrique dos; Vieira, Paula Melo de Abreu; Silva, André Talvani Pedrosa da; Costa, Daniela Caldeira; Coelho, Eduardo Antônio Ferraz; Santos, Silvana Maria ElóiA falta de uma terapêutica tripanocida eficiente, principalmente na fase crônica da doença de Chagas e sem a presença de efeitos adversos intensos impulsiona a pesquisa para o desenvolvimento de novos fármacos. As substâncias produzidas através do metabolismo secundário de plantas podem apresentar diferentes efeitos biológicos e serem utilizadas como princípios ativos no tratamento de doenças. Dessa forma, o objetivo desse trabalho foi caracterizar quimicamente os óleos essenciais extraídos das espécies Cymbopogon densiflorus, Cymbopogon nardus, Melaleuca leucadendron e Microlicia graveolens, bem como avaliar a atividade anti-Trypanosoma cruzi dos fármacos livres e após encapsulamento em sistemas nanoestruturados. A obtenção desses óleos ocorreu a partir da hidrodestilação das partes aéreas, com rendimentos em torno de 0,1 a 2,0% de acordo com a espécie. A caracterização realizada através da cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas permitiu a identificação de mais de 90% dos compostos, com presença majoritária de monoterpenos oxigenados. A partir da análise in silico foi possível prever inicialmente que todos os óleos em estudo apresentariam potencial contra o parasito T. cruzi. No entanto, na avaliação in vitro desta atividade utilizando a cepa Tulahuen, somente o óleo de folhas de C. densiflorus se revelou ativo, a partir de uma CI50 sobre o parasito equivalente a 60 μg/mL (IS= 3,8). No ensaio de permeabilidade de membrana do parasito, concentrações superiores a 30 μg/mL de óleo apresentaram diferenças em relação ao controle. Este resultado foi confirmado através da microscopia eletrônica de transmissão. Além disso, sistemas nanoemulsionados, lipossomais e micelares carregados de óleo essencial e/ou benznidazol foram desenvolvidos e apresentaram tamanho em escala nanométrica (<500 nm). A adição dos princípios ativos favoreceu a homogeneidade de distribuição de tamanho para todas as formulações. Além disso, potencial zeta negativo e um pH ácido também definiram as formulações. A estabilidade dos sistemas foi avaliada e apenas os lipossomas contendo ambos os fármacos foram instáveis. As formulações foram capazes de reproduzir a atividade tripanocida apresentada pelo óleo e benznidazol a partir de concentrações inferiores quando comparadas aos fármacos livres. No entanto, as micelas foram caracterizadas pelos maiores índices de seletividade e um efeito sinérgico foi comprovado quando ambos os fármacos foram encapsulados concomitantemente nessa forma farmacêutica. Sendo assim, os resultados desse trabalho demonstram o óleo essencial de folhas de C. densiflorus como candidato potencial ao tratamento da doença de Chagas, o qual é capaz de eliminar o T. cruzi in vitro a partir de baixas concentrações. Em adição, as formas micelares contendo benznidazol podem ser uma alternativa na quimioterapêutica chagásica tanto na sua forma simples, bem como, em combinação com o óleo essencial de C. densiflorus.Item Influência da doença de Chagas na farmacocinética do Benznidazol no modelo cão.(2022) Bandeira, Lorena Cera; Carneiro, Cláudia Martins; Pinto, Leonardo Santos Ribeiro; Carneiro, Cláudia Martins; Pinto, Leonardo Santos Ribeiro; Diniz, Andrea; Moreira, Fernanda de Lima; Veloso, Vanja Maria; Jeremias, Wander de JesusA alta variabilidade na eficácia e na segurança da quimioterapia anti-chagásica envolvendo o benznidazol (BNZ) pode ser devido às alterações farmacocinéticas. Tais alterações podem ser ocasionadas pela inibição de enzimas de metabolismo e transportadores de membranas devido ao aumento de mediadores do processo inflamatório na doença de Chagas. O presente estudo avaliou o impacto das infecções experimentais aguda e crônica pela cepa Be-78 do T. cruzi na farmacocinética do BNZ no modelo cão. Foram investigados 19 cães (n= 10 cães com infecção aguda; n= 9 cães com infecção crônica), SRD, com idade entre 04-10 meses e peso entre 20-35 kg. Os cães de ambas as fases da infecção foram divididos em dois grupos, sendo o Grupo I (infectado não tratado) e Grupo II (infectado e tratado). O estudo foi divido em 4 ocasiões. Na Ocasião 1 (antes da infecção) foi realizada coleta de sangue para análise de perfil das citocinas IL-6, IFN-γ, IL-10 e TNF-α por meio de ensaio de ELISA. Na Ocasião 2 (após a infecção, antes do início do tratamento) foi coletado sangue para análise de citocinas e carga parasitária por meio de qPCR. Na Ocasião 3 (após 10, 30, 40 e 60 dias de dose múltipla oral 3,5mg/Kg/12h de BNZ) foi realizada coleta seriada de sangue no intervalo de dose de 12h para análise farmacocinética para o Grupo II; e coleta de sangue para análise de citocinas e carga parasitária para os Grupos I e II. Na Ocasião 4 (após 30 dias do término do tratamento) foi coletado sangue para análise de citocinas e carga parasitária. O BNZ nas amostras de soro foi quantificado por CLAE-DAD. O método bioanalítico validado seguindo o guia da ANVISA, apresentou ausência de efeitos matriz e residual; limites de quantificação, estabilidade, precisão e exatidão compatíveis para a análise do BNZ em soro. Os parâmetros farmacocinéticos do BNZ, obtidos a partir de um modelo não compartimental, foram similares entre os momentos de coleta seriada na Ocasião 3 na fase aguda e também na fase crônica da infecção. O perfil farmacocinético do BNZ obtido em cães na fase aguda da doença é semelhante ao observado em cães sadios (dados históricos do nosso grupo de pesquisa). Por outro lado, foi observado que a infecção crônica aumenta os valores de Cmax (9,70 vs 17,97), Css (7,70 vs 12,56) e AUC0-12 (90,39 vs 150,76), e ainda reduz Vdss (17,34 vs 9,20) e CLss (0,84 vs 0,56) quando comparados com o grupo de cães sadios. Em relação a fase aguda, a fase crônica também eleva os valores de Cmax (10,55 vs 17,97), Css (7,08 vs 12,56), Cmin (4,32 vs 8,25) e AUC0-12 (84,98 vs 150,76) e reduz Vdss (13,92 vs 9,20) e CLss (0,99 vs 0,56). Os mediadores inflamatórios IFN-γ, IL-10, TNF-α e IL-6 estão aumentados nas fases aguda e crônica da doença, sendo a IL-6 a citocina produzida em maior quantidade e a única com aumento significativo (em até 7 vezes) de suas concentrações séricas nos cães da fase crônica em relação à fase aguda, mesmo quando o tratamento com o BNZ é administrado. Nos grupos I e II da fase aguda é observada uma elevada carga parasitária na Ocasião 2 que é reduzida significativamente nas Ocasiões 3 e 4. Nos grupos I e II da fase crônica observa-se uma baixa carga parasitária nas Ocasiões 2 e 3, e um aumento significativo da carga parasitária na Ocasião 4. Portanto, a infecção crônica experimental pela cepa Berenice-78 do T. cruzi altera significativamente a farmacocinética do BNZ em cães, provavelmente pela inibição do transporte de membrana glicoproteína-P (P-gp) causada pelo aumento da citocina pró-inflamatória IL-6.Item Obtenção e estudo de adesivo tópico, radioluminescente e antioxidante para potencial aplicação como dosímetro e radioprotetor no tratamento radioterápico.(2021) Murase, Mariane Satomi Weber; Santos, Orlando David Henrique dos; Santos, Orlando David Henrique dos; Ferreira, Giovana Ribeiro; Silva, Mariana de Melo; Nicolucci, Patrícia; Ruela, Andre Luís MoraisO câncer é uma das principais causas de morbidade e mortalidade no mundo e a radioterapia é um dos tratamentos mais efetivos para a cura, sendo requerido em, pelo menos, 50% dos casos da doença. Porém, seu desempenho pode ser afetado por diversos fatores, de forma que frequentemente são noticiados casos de doses errôneas aplicadas durante o tratamento. Além disso, a utilização não monitorada da radiação pode danificar células saudáveis, como as da pele. Neste contexto, este trabalho traz uma proposta inédita: unir em um filme uma substância capaz de proteger a pele dos danos causados pela radioterapia e um material que apresente mudanças óticas frente a radiação e possa servir como um indicador de dose. Para tanto, foram estudados, por espectroscopia de luminescência e de absorção no UV-Vis, os comportamentos óticos frente à radiação ionizante (Raios x) de dois cintiladores plásticos: 2,5-difeniloxazol (PPO) e 1,4-di(5-fenil-2-oxazolil)benzeno (POPOP), e de um polímero conjugado: poli[2-metóxi,5-(2'etil-hexiloxi)-p-fenilenovinileno] (MEH-PPV). Foram preparados filmes contendo estas substâncias em matrizes de poliestireno (PS) e policloreto de vinila (PVC) e a influência dessas no comportamento ótico dos filmes foi avaliada. Além disso, foi desenvolvido um filme contendo N-acetilcisteína (NAc), um derivado da cisteína que apresenta ação antioxidante e tem grande potencial para tratamento de lesões cutâneas. Possíveis interações entre a substância antioxidante e a matriz polimérica foram avaliados por espectroscopia de absorção na região do infravermelho (espectroscopia IV), já o perfil de liberação da substância ativa foi avaliada por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). Os espectros dos filmes de PS apresentaram resposta apenas a doses altas. Já os filmes de PVC apresentaram boa resposta ótica a doses baixas e, portanto, se mostraram mais promissores como dosímetro para doses baixas de radiação ionizante. Os resultados da espectroscopia IV mostraram que não houve interação química entre a substância antioxidante e a matriz polimérica e, portanto, foi possível admitir que a NAc manteve suas propriedades. Não obstante, foram preparados filmes com ambas as propriedades: radioluminescentes e antioxidantes. Esses foram preparados com três metodologias distintas e suas propriedades óticas e de liberação também foram analisadas. Os resultados mostraram que a deposição do filme antioxidante sobre o filme radioluminescente apresentou os melhores resultados para a aplicação desejada. O filme obtido se mostrou de grande potencial como dosímetro e radioprotetor para aplicação no tratamento radioterápico, sendo necessária a realização de testes quantitativos e in vivo, em estudos posteriores.Item Diagnóstico de SARS-CoV-2 : uma revisão sistemática e o desenvolvimento de um biossensor com nanobastões de ouro.(2022) Dias, Bruna de Paula; Silva, Breno de Mello; Silva, Breno de Mello; Almeida, Isabela Neves de; Figueiredo, Rute Cunha; Rodrigues, Rodrigo Araújo Lima; Ruiz, Alessandra Cristina GomesDeterminadas infecções virais causam morbidade e mortalidade em todo o mundo e alguns surtos atraíram a atenção nos últimos tempos. No contexto da atual pandemia, a realização do diagnóstico rápido e preciso da COVID-19 é uma estratégia eficaz para o controle da doença, permitindo a triagem e garantindo a intervenção terapêutica oportuna. Frente a isso, diversos testes rápidos e a construção de biossensores foram desenvolvidos nos últimos tempos na busca de uma ferramenta de diagnóstico para serem usadas no ponto de atendimento. Nesse contexto, o presente trabalho analisou relatórios científicos sobre testes rápidos para o diagnóstico de COVID-19 para avaliar seus parâmetros de confiabilidade e propôs desenvolver um biossensor com nanobastões de ouro para detecção de SARS-CoV-2. Para isso, termos ou palavras- chave referentes a testes de diagnóstico rápido e testes de ponto atendimento para SARS-CoV-2 e COVID-19 foram pesquisados em dados publicados de novembro de 2020 a novembro de 2021 nos bancos de dados PubMed e Google Scholar. Para o biossensor, a superfície dos nanobastões foi modificada com polietilenoimina e com anticorpos anti-SARS-CoV-2 (0,25 μg/mL) e testados em seguida contra diferentes concentrações do vírus. Nos relatórios científicos, foram observadas diferenças na sensibilidade entre os testes diretos que usaram amostras distintas, e uma boa acurácia em amostras com valores altos de Ct (RT-PCR). Também se observou falta de sensibilidade nos testes para detecção de anticorpos nos primeiros dias após a infecção, com valores crescentes na análise pós-infecção. Reação cruzada com outros patógenos foi relatada. A maioria dos testes analisados em nosso estudo ainda precisam ser aprimorados para testar a reatividade cruzada contra outros patógenos, principalmente contra outros coronavírus. No que se refere ao biossensor, os nanobastões foram sintetizados pelo método de crescimento com sementes usando hidroquinona como agente redutor e mostrou-se reprodutível e estável por um ano quando armazenado em geladeira. O biossensor proposto foi capaz de diferenciar o vírus alvo do controle apenas em concentrações mais altas do vírus (106 UFP/ml). O uso de Triton X-100 não se mostrou eficaz para melhorar a sensibilidade do biossensor, porém em amostras aquecidas os resultados se mostraram melhores quando comparados a amostras não aquecidas. Novos ensaios deverão ser realizados para o aprimoramento do desenvolvimento de um produto que explore adequadamente as propriedades únicas dos nanobastões de ouro.Item Avaliação in vitro e in vivo da capacidade antioxidante da isobenzofuran-1(3H)-ona no desequilíbrio redox induzido por diquat no cérebro de ratos Wistar.(2022) Ribeiro, Iara Mariana Léllis; Nogueira, Katiane de Oliveira Pinto Coelho; Oliveira, Laser Antônio Machado de; Nogueira, Katiane de Oliveira Pinto Coelho; Menezes, Cristiane Alves da Silva; Oliveira, Jade de; Engel, Daiane FátimaO sistema nervoso é uma rede complexa de células especializadas que transmitem sinais por diferentes partes do corpo para comunicação e controle de funções como emoções, pensamento, comportamento e memória. O alto consumo de oxigênio, níveis antioxidantes relativamente baixos e pouca capacidade regenerativa fazem com que o tecido cerebral seja especialmente suscetível a danos oxidativos e, consequentemente, à neurodegeneração. O diquat (DQ), um herbicida amplamente utilizado na agricultura, é um exemplo de estressor exógeno capaz de sobrecarregar o sistema antioxidante desencadeando danos oxidativos em órgão como o cérebro, fígado e rins. Uma alternativa para a manutenção da homeostase redox diante de agentes estressantes é a utilização de compostos que reparem e substituam biomoléculas oxidadas. Dentro deste contexto, um derivado de isobenzofuran-1(3H)-ona (composto 1) foi avaliado in vitro e in vivo, quanto ao seu poder antioxidante sobre o desequilíbrio redox induzido por DQ. Nos ensaios in vitro, realizados em culturas primárias de neurônios hipocampais, foram avaliados o metabolismo celular, os níveis intracelulares de EROs e os níveis de peroxidação lipídica. Nos estudos in vivo foram realizados, teste bioquímicos, avaliação morfológica do hipocampo e avaliação comportamental de ratos Wistar submetidos ao tratamento com o composto 1 e expostos ao DQ. Os resultados dos testes in vitro mostraram que o tratamento com o composto 1 diminuiu os níveis intracelulares de EROs e a peroxidação lipídica dos neurônios expostos DQ. Nos resultados in vivo, as análises enzimáticas mostraram uma redução significativa da atividade da superóxido dismutase no grupo exposto ao DQ com ou sem tratamento com o composto 1 e um aumento nos níveis da glutationa reduzida no grupo tratado com o composto 1 e exposto ao DQ, o tratamento com o composto 1 também gerou diminuição nos níveis de peroxidação lipídica e proteínas carboniladas no cérebro dos animais expostos ao DQ. A análise morfológica do hipocampo dos ratos expostos ao DQ mostrou aumentos no número neurônios lesionados. O tratamento com o composto 1 reduziu os neurônios lesionados nas regiões CA1 e giro denteado. No teste comportamental observou-se que os animais tratados ou não com o composto 1 e expostos ao DQ apresentaram redução da capacidade locomotora no teste de campo aberto e o tratamento com o composto 1 isoladamente mostrou indicativo de ação ansiolítica. Concluímos, que a exposição ao DQ afeta a homeostase redox, causando danos às células e tecidos analisados, no entanto, esses danos podem ser amenizados pelas propriedades antioxidantes do composto 1.Item Prospecção funcional e potencial biotecnológico de bactérias associadas a anuros do Quadrilátero Ferrífero.(2022) Cordeiro, Isabella Ferreira; Moreira, Leandro Marcio; Moreira, Leandro Marcio; Becker, Carlos Guilherme; Blamires, Daniel; Pires, Maria Rita Silvério; Azevedo, Cristiano Schetini deA contaminação por metais e metaloides tóxicos, natural ou mediada por ação antrópica, tem se tornado um grave problema ambiental, acarretando danos a diversos seres vivos, em especial ao homem. Porém, alguns organismos presentes em distintos níveis tróficos são mais sensíveis a estes contaminantes, e um bom exemplo disso são os anfíbios. Por apresentarem tecido epitelial altamente permeável sofrem mais pela ação destes compostos, o que os colocam, na maioria das vezes, como potenciais bioindicadores de contaminantes. O presente trabalho teve como objetivos prospectar bactérias da pele de anfíbios anuros capazes de tolerar ao arsênio, bem como investigar possíveis relações desta tolerância como mecanismos práticos de aplicação biotecnológica. Para isso, duas investigações paralelas foram conduzidas. Num primeiro momento, isolados bacterianos advindos exclusivamente de anuros de um ambiente contaminado por metais pesados (Estação Ecológica do Tripuí - Ouro Preto, MG) foram avaliados. Para esta abordagem ficou constatado que espécies que possuiam íntimas associações com a água durante seu ciclo reprodutivo apresentam microbiota cultivável mais tolerante e ao mesmo tempo com maior potencial de produção de biofilme, contrapondo-se a microbiota advinda de animais que apresentam menor contato com a água. Considerando que os ambientes aquáticos em áreas contaminadas possuem maior disponibilidade para contato com os organismos vivos, tais resultados são indicativos que tal tolerância e adaptação fisiológica podem contribuir fortemente para a manutenção da sobrevivência da espécie anura quando em contato com estes ambientes no Quadrilátero Ferrífero (QF). Em um segundo momento, a microbiota cultivável associada a cinco espécies da região do QF foi comparada com a microbiota cultivável associada às mesmas espécies, porém advindas de um ambiente não contaminado, localizado a 320 km de distância do primeiro, no Município de João Neiva, ES. Os resultados evidenciaram que a microbiota proveniente das espécies do QF apresentam uma maior tolerância ao arsênio e foram capazes de proteger os anuros da permeabilidade deste metalóide, o que nao foi observado na microbiota advinda das espécies de ambiente não contaminado. Tais dados são indicativos da contribuição desta microbota na manutenção da sobrevivência dos anuros, reiterando os dados apresentados pela primeira abordagem. Como conclusão, os resultados auxiliaram a melhor compreensão desse modelo de interação, bem como classificam potenciais isolados com aplicações biotecnológicas que podem ser melhor exploradas quanto aos possíveis mecanismos moleculares associados a esta notória tolerância.Item Predição metabólica e prospecção de bactérias biocontroladoras e promotoras de crescimento vegetal obtidas em cavernas ferruginosas do Quadrilátero Ferrífero como potenciais inoculantes.(2022) Lemes, Camila Gracyelle de Carvalho; Moreira, Leandro Marcio; Moreira, Leandro Marcio; Santos, Taides Tavares dos; Oliveira, Fábio Soares de; Cruz, Izinara Rosse da; Ribeiro, Sérvio PontesO Quadrilátero Ferrífero (QF) possui elevada concentração de minérios no solo, o que leva ao alto extrativismo, fato este que se contrapõe à sua importância biológica por desencadear perdas de biodiversidade e de possíveis potenciais biotecnológicos, por exemplo a partir da microbiota. Nesse ambiente, as cavernas ferruginosas se apresentam como paisagens com características geomorfológicas distintas, como diferentes altitudes e composição estrutural. Este trabalho teve como objetivos gerais realizar a predição metabólica funcional (anál. independ. de cult) e prospectar bactérias biocontroladoras e promotoras de crescimento vegetal (BPCV) (métodos dependentes de cultivo) a partir de substratos provenientes de cavernas ferruginosas do QF. Para isso, foram coletadas amostras de piso e teto de sete cavernas ferruginosas, uma amostra de caverna de quartzito e uma amostra de solo externa às cavidades. Inicialmente, foi realizada uma análise em larga escala da sequência do gene 16S rRNA (parte finalizada no mestrado) e a predição funcional (realizada ao longo do doutorado). Em paralelo, foi realizado o isolamento, cultivo e verificação das atividades de biocontrole e biofertilização. Na análise de predição metabólica, categorias de interesse biotecnológico mostraram diferenças estatísticas entre a amostra de caverna quartzítica e as amostras das cavernas ferruginosas, sendo encontradas maiores proporções de sequências para as categorias: mecanismos de transdução de sinal, metabolismo do nitrogênio, biossíntese de novobiocina e sistema de secreção. Um total de 563 isolados cultiváveis foram obtidos, catalogados e cultivados em placas de 96 poços, compondo matrizes de ensaios de inibição in vitro contra os fitopatógenos Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc306), Fusarium oxysporum e Colletotrichum lindemuthianum (Cl89). Os resultados mostraram que 47 isolados inibiram Xcc306, sendo que nenhum isolado da amostra de solo externa às cavidades apresentou resultados positivos. Entre os isolados que inibiram o Xcc306 in vitro, nove reduziram entre 36-68% da lesão causada pelo Xcc306 quando co-inoculados em plantas de limão-cravo, sem induzir resposta de hipersensibilidade. Vinte dos 47 inibiram o crescimento de Fusarium sp. diretamente em 51-73% e 15 indiretamente em 75-81%. Esses 15 inibiram o crescimento de Cl89 in vitro (até 93% diretamente e 100% indiretamente), fixaram nitrogênio, produziram proteases e sideróforos, mostraram capacidade de motilidade, produziram biofilme e exceto 1 isolado (A1), todos solubilizaram fosfato inorgânico. Os isolados com propriedades mais relevantes para candidatos a BPCV foram identificados como Serratia sp., Dickeya sp., e Nissabacter sp. Este trabalho apresenta pela primeira vez o potencial bacteriano associado a cavernas ferruginosas previamente desconhecidas para aplicação agrícola e ambiental, como candidatos a potenciais inoculantes biológicos.Item Genomics and walnut hull proteomics of Xanthomonas arboricola pv. juglandis 417 for the development of new disease control.(2021) Assis, Renata de Almeida Barbosa; Moreira, Leandro Marcio; Dandekar, Abhaya M.; Moreira, Leandro Marcio; Ferro, Jesus Aparecido; Souza, Robson Francisco de; Cruz, Izinara Rosse da; Borges, William de CastroXanthomonas arboricola pv. juglandis 417 (Xaj417) is the causal agent of walnut bacterial blight, the most significant above-ground disease of walnuts (Juglans regia L.). Walnut producers have registered losses of up to 40% in local production annually. Disease management uses copper-based pesticides which induce pathogen resistance despite being harmful for the environment. Our aim was to evaluate the genome content of the pathogen, dissect the host-pathogen response to define determinants that regulate the host susceptibility and assess the mutation effect of a conserved secreted protein among plant-associated Xanthomonadaceae. Our study focused on Xaj417 to understand the proteo-genomics attributes to colonize its host. We investigated the genome sequence and proteome of this plant pathogen by performing a comparative analysis with other sequenced Xaj and inoculating walnut fruits with Xaj417. The comparison of 32 Xaj genomes revealed that the adaptive evolution generated by intensive spray application to control bacterial diseases possibly led to selection of resistant bacteria and emergence of pathogenic strains (Chapter I). The results revealed that bacterial virulence and copper resistance emerged by the acquisition of specific sets of pathogenesis-related genes commonly transferred among the members of the Xanthomonas genus on mobile genetic elements. This was evidenced for the reference strain Xaj417, a copper-resistant Californian isolate, that acquired a new copper resistance cassette by HGT associated with a new transposon family in Xanthomonas (TnXaj417). The expansion of mobile genetic elements in the most virulent strains influence the repertoire of virulence effectors and adaptation strategies shaping the evolution of pathogenic strains. On Chapter II, we dissected this pathosystem using tandem mass tag quantitative proteomics. This is the first proteome study of this pathosystem examining the molecular responses during the disease development by comparing the proteomes of infected fruit hulls to healthy tissue. Xaj proteins detected in infected tissues demonstrated its ability to adapt to the host microenvironment, limiting iron availability, coping with copper toxicity, and maintaining energy and intermediary metabolism. Finally, on Chapter III the secreted monofunctional chorismate mutase mutant (XajCM) was created in Xaj417 and showed increased virulence in walnut nuts. The bacterial morphology was characterized and IX changes in the protein profile of the mutant in planta were tested. The proteomic results suggested intense degradation processes, oxidative stress, and general arrest of the biosynthetic metabolism in infected nuts. Overall, this study offers new insights into the emergence of virulence, adaptation, and tolerance to disease management strategies used in orchard ecosystems. It also provides knowledge into molecular mechanisms highlighting potential molecular tools for early detection and disease control strategies.Item Inovações na produção de enzimas do fungo Chrysoporthe cubensis e seus reflexos na sacarificação do bagaço de cana-de-açúcar.(2018) Albuquerque, Mariana Furtado Granato de; Rezende, Sebastião Tavares de; Guimarães, Valéria Monteze; Rezende, Sebastião Tavares de; Almeida, Maíra Nicolau de; Andrade, Milton Hércules Guerra de; Monteiro, Paulo Sérgio; Brandão, Rogélio LopesO presente trabalho avaliou o efeito de métodos de pré-tratamento, ainda não testados, na hidrólise do bagaço de cana realizada com coquetéis enzimáticos fúngicos produzidos on-site. Além disso, o extrato enzimático de C. cubensis foi melhorado, por meio de alterações em suas condições de cultivo, e as enzimas α-arabinofuranosidases desse fungo foram purificadas, caracterizadas e avaliadas na hidrólise do bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado alcalino. Os melhores resultados mostraram que o prétratamento hidrotérmico permitiu a conversão de mais de 60% da glicana pelo blend enzimático C. cubensis-P.pinophilum, além de diminuir a necessidade de hemicelulases no processo. O farelo de trigo se destacou, em relação ao capim elefante e ao bagaço de cana-de-açúcar, como fonte de carbono no crescimento do C. cubensis. O melhor extrato enzimático, obtido a partir do crescimento do fungo em uma mistura do farelo de trigo e farinha de beterraba, na proporção 1:1, se mostrou mais completo e eficiente na sacarificação do bagaço de cana submetido ao pré-tratamento ácido ou alcalino, se comparado ao extrato enzimático obtido com farelo de trigo puro. A partir desse coquetel, foram purificadas e caracterizadas duas α-arabinofuranosidases, denominadas α-Ara1 e α-Ara2. As duas enzimas foram satisfatoriamente estáveis a 50 °C, com meiavidas de 68 e 77 horas, respectivamente, e apresentaram pH e temperatura ótimos próximos a 4,0 e 60 °C. A α-Ara1 foi identificada como membro da família GH51 e a αAra2 como uma GH54. Se comparada à α-Ara1, α-Ara2 apresentou maior atividade específica em diferentes substratos, além de maiores eficiências catalíticas ao atuar sobre substratos naturais e complexos, provavelmente devido à presença do domínio de ligação à carboidrato CBM42, presente na estrutura desse enzima. A suplementação do coquetel comercial Multifect® CL com a α-Ara2 aumentou 1,6 vezes e liberação de glicose e 3,6 vezes a produção de xilose. Resultado idêntico foi observado após a combinação do coquetel comercial com as duas α-arabinofuranosidases purificadas, o que indicou sinergismo entre as mesmas. Portanto, o presente estudo contribui para maior conhecimento dos efeitos de diferentes pré-tratamentos na atuação das enzimas produzidas por C. cubensis, bem como traz algumas inovações relacionadas ao processo de produção de enzimas desse fungo e ao estudo de novas α-arabinofuranosidases com potencial para aplicação na indústria de etanol lignocelulósico.Item Análises de QTL e genômica comparativa para estudar mecanismos regulatórios da H+-ATPase de membrana.(2021) Barbosa, Patrícia Gonçalves Prates; Brandão, Rogélio Lopes; Cunha, Aureliano Claret da; Cruz, Izinara Rosse da; Brandão, Rogélio Lopes; Fietto, Luciano Gomes; Mendes, Tiago Antônio de Oliveira; Andrade, Milton Hércules Guerra de; Silva, Silvana de QueirozA H+ -ATPase é uma proteína presente na membrana citoplasmática de plantas e fungos e desempenha um papel essencial na geração de um gradiente eletroquímico de prótons, importante para a captação de nutrientes e regulação do pH intracelular. A ativação da H + -ATPase da membrana citoplasmática em Saccharomyces cerevisiae induzida por glicose é supostamente atribuída a um sinal de cálcio intracelular correlacionado ao metabolismo do fosfatidilinositol. Em estudos anteriores do nosso grupo de pesquisa, foi observada diferença de fenótipo entre as cepas S. cerevisiae BY4742 arg82Δ e PJ69 arg82Δ através do teste de atividade da H + -ATPase, indicando que o fenótipo de maior ativação da H + -ATPase está relacionado a vários genes. Diante do exposto, o objetivo deste trabalho foi utilizar diferentes abordagens genômicas para identificar novos componentes da regulação induzida por glicose da H + -ATPase. Para isso, foram realizados o sequenciamento do genoma segregante agrupado, mapeamento de QTLs e análises de Bioinformática para identificar o possível motivo da diferença de fenótipo e, ou, novos componentes desta via de transdução de sinal. Uma vez identificadas as variantes na análise de mapeamento de QTL foi desenvolvido o script SNPsInQTLselection.py para identificar as bases genéticas que podem estar envolvidas com o fenótipo de maior atividade da H+ -ATPase. Após a utilização desse script foram identificadas 42 variantes em 33 genes potencialmente envolvidos com o fenótipo de interesse. Para priorização desses genes candidatos foi realizado análise de enriquecimento e interatoma que permitiram identificar 10 genes enriquecidos e envolvidos na via da telomerase e do fosfatidilinositol (STT4, PIK2, UGA2, EST1, MEC3, HEK2, TOP3, PSO2, STO1, FUR4). Cepas do background BY contendo essesrespectivos genes deletados (coleção EUROSCARF) foram utilizadas para teste de fenótipo de acidificação extracelular e sinalização de cálcio induzida por glicose. Por meio desses testes, 4 (UGA2, FUR4, EST1 e STT4) dos 10 genes enriquecidos, apresentaram o fenótipo de maior ativação da H+ -ATPase, fenótipo esse evidenciado nos testes de acidificação extracelular e sinal de cálcio. Destes 4 genes, vale destacar o STT4 visto que, de acordo com a função descrita para esse gene na literatura o fosfatidilinositol-4-fosfato pode exercer um papel na regulação da via de ativação de H + -ATPase, controlando a atividade da fosfolipase C. Tendo em vista uma relação positiva entre atividade da H + - ATPase e desempenho fermentativo, estudos futuros podem ser feitos com os genes/alelos identificados neste trabalho, com aplicação em cepas de leveduras industriais 8 visando a melhoria na eficiência de processos fermentativos. Os genes (UGA2, FUR4, EST1 e STT4) merecem investigação detalhada para verificação do possível envolvimento na via de sinalização da H+ -ATPase. Esse trabalho apresenta pela primeira vez uma estratégia de Bioinformática para identificar genes candidatos quando o resultado do mapeamento de QTL não for significativo.Item Desenvolvimento e validação de ferramentas computacionais de apoio ao diagnóstico citopatológico do câncer do colo do útero.(2021) Rezende, Mariana Trevisan; Carneiro, Cláudia Martins; Bianchi, Andrea Gomes Campos; Carneiro, Cláudia Martins; Consolaro, Márcia Edilaine Lopes; Claro, Itamar Bento; Travençolo, Bruno Augusto Nassif; Vieira, Paula Melo de AbreuUma das causas dos resultados falso-negativos e falso-positivos do exame de Papanicolaou são fatores subjetivos atrelados a análise microscópica realizada por citopatologistas. A visão computacional tornou-se uma importante estratégia de melhoria da qualidade do exame, permitindo a construção, validação e implementação de ferramentas computacionais para auxiliar o diagnóstico selecionando áreas do esfregaço prováveis de apresentar alterações citopatológicas. Apesar do aprendizado de máquina se mostrar promissor para minimizar as deficiências do exame, até o momento, a visão computacional não é tão aplicada à citologia convencional. Principalmente devido ao custo dos métodos semi-automáticos disponíveis e ao uso mais difundido da citologia em meio líquido em países de alta renda. Entretanto, diversos países no mundo ainda usam a citologia convencional e não há previsão para substituição. Assim, depara-se com ausência de estudos e de base de dados de citologia convencional, que impedem avanços no desenvolvimento de algoritmos de segmentação e classificação. Nesse contexto, o primeiro objetivo específico desse trabalho foi identificar a viabilidade de implementação de métodos semi-automáticos disponíveis para triagem de lâminas cervicais por meio de uma revisão integrativa da literatura; o segundo objetivo foi desenvolver uma plataforma web e uma coleção de dados de imagens de citologia convencional; o terceiro objetivo foi desenvolver e validar algoritmos de classificação de células cervicais. A revisão integrativa mostrou que os métodos semi-automáticos mais usados foram o ThinPrep Imaging System e o BD FocalPoint GS Imaging System. Apontou ainda que os métodos semi-automáticos são relevantes no monitoramento da qualidade em citopatologia cervical, porém existem lacunas relacionadas ao custo, logística dos equipamentos e uso da citologia convencional. Neste sentido, foi desenvolvido a CRIC Searchable Image Database, plataforma web de dados de imagens e a CRIC Cervix, coleção de dados de imagens do exame de Papanicolaou convencional, com 11.534 células classificadas, até o momento, é a maior base de dados de células cervicais. Esses dois produtos, publicamente disponíveis, já suportam pesquisas reprodutíveis em visão computacional. O primeiro algoritmo baseado em intensidade e área nuclear mostrou ótimo desempenho nas imagens sintéticas com precisão mais alta que outros trabalhos, ou seja, obteve-se menos resultados falso-positivos. Entretanto, o desempenho foi razoável nas imagens convencionais. O segundo algoritmo baseado em atributos não geométricos extraídos dos núcleos teve precisão de 89,7% e de 85,1% para a classificação em duas classes (células normais e alteradas) e três classes (normal, alteração de baixo grau e de alto grau), com falso-negativos de 3,41% e 1,87%, respectivamente. Os resultados foram satisfatórios, visto que os falso-negativos na rotina laboratorial podem chegar a 62%. A especificidade foi de 83,3% e de 77,8%, para duas e três classes, apontando que os falso-positivos não foram significativos, ainda mais que, posteriormente, esses campos serão avaliados pelo especialista. Os resultados dos algoritmos mostram que é importante basear a extração dos atributos computacionais nos critérios citomorfológicos utilizados pelos citopatologistas para obtenção de resultados mais assertivos. As soluções geradas abrem possibilidades concretas para avançar esforços no desenvolvimento de métodos computacionais de apoio a análise microscópica clássica do exame de Papanicolaou convencional.Item Parâmetros epigenéticos e parasitológicos associados à esquistossomose mansônica em camundongos C57BL/6 EBi3-/-.(2020) Mota, Ester Alves; Cota, Renata Guerra de Sá; Cota, Renata Guerra de Sá; Babá, Élio Hideo; Cabral, Fernanda Janku; Andrade, Milton Hércules Guerra de; Soares, Rodrigo Dian de Oliveira AguiarA hipótese desse trabalho é que o parasito Schistosoma mansoni em resposta ao sistema imune do hospedeiro mamífero altera seu estado epigenético e modula o estado epigenético do hospedeiro definitivo, e consequentemente a extensão do granuloma hepático. Para investigar essa hipótese foi utilizada a infecção em modelo murino C57BL/6 EBi3-/- e delineados os objetivos específicos: (i) a investigação dos efeitos parasitológicos; (ii) se o parasito modularia mecanismos epigenéticos no hospedeiro; (iii) se o hospedeiro poderia afetar a expressão de genes relacionados a mecanismos epigenéticos do parasito; (iv) avaliar a expressão de miRNAs e lncRNAs de S. mansoni no modelo C57BL/6 EBi3-/- bem como o potencial desses ncRNAs como biomarcadores (v) avaliar a expressão de genes relacionados a epigenética na cepa LE do S. mansoni resistente ao praziquantel (LE-PZQ). Foram utilizados camundongos C57BL/6 WTC (selvagem controle), WTI (selvagem infectado), EBi3-/-C (nocaute controle) e EBi3-/- I ( nocaute infectado) todos com 55 dias de infecção, 100 cercárias. Nos experimentos com S. mansoni, foram utilizados pool de parasitos recuperados de camundongos WT (LE-controle), cepa LE-PZQ e recuperados de EBi3-/- (LE de EBi3-/- ). Os resultados mostram que a esquistossomose murina no modelo C57BL/6 EBi3-/- I apresenta uma diminuição no dano hepático, no volume e número dos granulomas e quantidade de ovos nas fezes em relação ao observado no grupo WTI, (p<0,05) A demetilação do DNA está mais ativa que a metilação em todos os grupos devido ao maior nível de expressão das TETs em comparação com a expressão das DNMTs, sendo que, quanto maior o número de granulomas, menor a expressão de TET3 e DNMT1 em EBi3-/- I (p<0,05) A infecção por S. mansoni induz uma diminuição no conteúdo de metilação global do DNA. Os vermes adultos machos, recuperados do modelo C57BL/6 EBi3-/- apresentaram uma diminuição no conteúdo de metilação global do DNA comparando com o macho controle, bem como diminuição na expressão de SmUSPs 7, 22, 46 e 49, o que pode afetar o turnover da via ubiquitinaproteassoma e alterar o padrão de ubiquitinação nas histonas. Já na cepa LE-PZQ o SmUSP15 foi o único gene up regulado em machos. Verificamos também que os miRNAs 190 e 125A possuem função sexo-específica em S. mansoni, o miR-190-3p foi o único encontrado no plasma de C57BL/6 EBi3-/- I. Os lncRNA5 6 e 7 foram detectados no plasma de C57BL/6 EBi3-/- . Os dados indicam uma modulação epigenética do hospedeiro mamífero no parasito e abrem perspectivas para a influência epigenética na interação parasito-hospedeiro.Item Efeitos de diferentes extratos de Bidens pilosa L. e da radiação luminosa no processo de isomerização da bilirrubina.(2020) Figueiredo, Bruna Inez Carvalho de; Santos, Orlando David Henrique dos; Bianchi, Rodrigo Fernando; Santos, Orlando David Henrique dos; Fontes, Elita Scio; Bechtold, Ivan Helmuth; Coelho, Bruno Nazário; Souza, Gustavo Henrique Bianco deA icterícia neonatal, ou hiperbilirrubinemia, ocorre em aproximadamente 60% dos neonatos a termo e 80% dos neonatos prematuros nas primeiras semanas de vida. A icterícia é a manifestação clínica de uma disfunção hepática, onde há o acúmulo de bilirrubina no organismo do recém nascido, podendo ocasionar em síndrome com lesão cerebral irreversível, conhecida como kernicterus. Apesar de décadas de estudos sobre o uso da fototerapia para o tratamento de icterícia neonatal, ainda hoje há um longo caminho a se percorrer em relação à otimização e padronização do tratamento. Neste contexto, o presente estudo busca compreender o efeito dos diferentes comprimentos de onda na isomerização da bilirrubina e avaliar a contribuição da planta Bidens pilosa para a otimização da fototerapia. Os resultados mostraram que a luz azul, quando comparada à luz verde e vermelha, apresentou eficácia superior na cinética de isomerização da bilirrubina. Além disso, foi demonstrado que as luzes vermelha e verde quando utilizadas em diferentes combinações não contribuíram para redução na concentração de bilirrubina. Também foram realizados testes com o intuito de comparar a eficácia da luz azul contínua em relação à luz azul pulsada/intermitente. Os resultados mostram que a luz pulsada apresenta uma eficácia superior à luz contínua, quando submetidas ao mesmo tempo de irradiação, e eficácia equivalente quando a luz intermitente é exposta à metade do tempo da luz contínua. Conclui-se que o intervalo de tempo na irradiação parece influenciar de forma positiva no processo de isomerização da bilirrubina, ocorrendo de forma mais rápida. Além disso, foi possível mostrar o importante papel da espécie Bidens pilosa na otimização da cinética de isomerização da bilirrubina, de forma que seu uso concomitante à fototerapia revelou uma melhora expressiva neste processo. Dessa forma, os resultados indicam a viabilidade de se realizar um tratamento diferenciado, principalmente no que diz respeito ao consórcio da fototerapia com a fitoterapia, otimizando o tratamento e contribuindo para a redução de casos de morbidade e mortalidade decorrentes da hiperbilirrubinemia.Item Estudo botânico, fitoquímico e avaliação in silico e in vitro de atividades biológicas de folhas de Humulus lupulus L. (Cannabaceae) cultivadas no Brasil.(2020) Silva, Regislainy Gomes da; Souza, Gustavo Henrique Bianco de; Sousa, Hildeberto Caldas de; Souza, Gustavo Henrique Bianco de; Costa, Fernando Batista da; Leite, João Paulo Viana; Martucci, Maria Elvira Poleti; Souza, Thiago Belarmino deA espécie Humulus lupulus L. (lúpulo) possui grande importância na indústria cervejeira, sendo suas flores femininas utilizadas para conferir o amargor e aroma característicos da bebida. Suas folhas são um subproduto agrícola, de potencial relevante. Devido à sua histórica utilização medicinal, é válido investigar outras possíveis aplicações biológicas. Nesse contexto, foram realizados estudos botânicos, fitoquímicos, predição de atividades biológicas e citotoxicidade de suas folhas. A coleta foi realizada em Baependi-MG e a exsicata depositada (OUPR 29768). Folhas adultas foram fixadas em FAA70 e armazenadas em etanol 70%, para os estudos botânicos. Outra parte do material foi seca, pulverizada e extraída em etanol, extrato etanólico bruto (EEB), que foi submetido a fracionamentos, obtendo-se frações hexânica (FH) e hidrometanólica (HM). A identificação das substâncias se deu por técnicas hifenadas. Foi realizada também a quantificação de fenólicos e flavonoides, bem como determinação da atividade sequestrante de radical DPPH. Os estudos in silico foram realizados através dos softwares Pass on line e Active-IT. Ao corte transversal, as folhas apresentaram mesofilo heterogêneo, com idioblastos cristalíferos contendo drusas; estômatos anomocíticos, somente na face abaxial, tricomas tectores em ambas as faces e glandulares apenas na face abaxial, sendo providos de cistólitos na epiderme adaxial. A quantificação de fenólicos e flavonoides no EEB foi 75,40 ± 8,04 mg EAG/g e 0,96 ± 0,12 mg ER/g, respectivamente; e na fração HM, os teores foram 89 ± 6,15 mg EAG/g e 7,13 ± 1,07 mg ER/g. Na avaliação do potencial antioxidante, obtevese CE50 de 105,60 µg/mL, 675,71 µg/mL e 126,72 µg/mL para o EEB, FH e HM. Através das análises por CLUE-DAD-EM/EM, foram identificados os flavonoides astragalina, nicotiflorina, caempferol-7-O-rutinosídeo, robinina, hiperina, rutina, quercetina-7-Orutinosídeo e mangaslina. EEB (800 µg/mL) e HM (1200 µg/mL) reduziram a viabilidade celular da linhagem T24 e estimularam o crescimento de MRC5 a 25 µg/mL, evidenciando a citotoxicidade seletiva. Após 24h de tratamento, não foi observada parada no ciclo celular em T24. A predição da atividade biológica dos flavonoides apresentou potenciais atividades antitumoral, citotóxica, entre outras. EEB reduziu a viabilidade das linhagens SK-mel-147 e HaCat (500 µg/mL), FH apresentou maior citotoxicidade em células tumorais, e, HM em células não tumorais.Item Desenvolvimento de carreadores lipídicos constituídos por lípides da flora amazônica com propriedade antioxidante contendo fragrâncias naturais para melhora do odor corpóreo relativo ao envelhecimento cutâneo.(2019) Kaufmann, Giana Thais; Santos, Orlando David Henrique dos; Goulart, Gisele Assis Castro; Santos, Orlando David Henrique dos; Goulart, Gisele Assis Castro; Silva, Elton Luiz; Carneiro, Guilherme; Souza, Gustavo Henrique Bianco de; Vieira Filho, Sidney AugustoCom o envelhecimento cronológico há uma redução dos sistemas intrínsecos antioxidantes da pele, resultando em danos cutâneos e geração de compostos responsáveis pelo odor característico da idade. No intuito de minimizar esses danos, propomos o desenvolvimento de nanopartículas lipídicas (nanopartículas lipídica sólidas- NLS e carreadores lipídicos nanoestruturados – CLN) constituídos de manteigas e óleos extravirgens provenientes da flora amazônica contendo fragrâncias naturais com habilidade de mascarar e harmonizar o odor relativo ao envelhecimento. Para composição da matriz lipídica das nanopartículas, as manteigas de ucuúba e de muru-muru e os óleos de patauá e de castanha-do-Brasil foram avaliados quanto às suas características físico-químicas, composição da fração insaponificável e em ácidos graxos e atividade antioxidante pelos métodos de DPPH, ABTS e proteção do ácido palmitoleico (AP) frente ao esqualeno hidroperóxido (EHP). A manteiga de ucuúba apresentou a maior concentração de fitosteróis (287 mg EC/100g), de compostos fenólicos totais (775 mg EAG/100g) e maiores índices de atividade antioxidante: EC50 de 0,83 mg/mL e 18,74 g ET/kg (DPPH) e 18,87 g ET/kg (ABTS). Com exceção da manteiga de muru-muru, todos os materiais demonstraram atividade antioxidante similar ao BHT frente ao EHP. Foram desenvolvidas 7 fragrâncias com óleos essenciais para cada gênero e avaliadas quanto a capacidade de mascarar e/ou harmonizar o odor relativo a idade e quanto à atividade antioxidante. Todas demonstraram capacidade de mascarar o odor do 2-nonenal sem diferenças significativas (p>0,05), porém as fragrâncias F4 e M4 potencializaram a harmonização do odor deste aldeído, sendo selecionadas. Na otimização da produção das NLS e CLN, com ou sem adição de F4 e M4, foram avaliados 7 tensoativos polihidroxilados, duas técnicas de produção (homogeneização a quente com sonda de ultrassom de alta potência - US e homogeneização por alta pressão - HAP) e duas condições de resfriamento (banho de gelo - BG e temperatura ambiente - TA). Todas as formulações foram avaliadas quanto a eficiência de encapsulação (EE) e recuperação do processo (RP) por CG-EM, tamanho de partículas, índice de polidispersão (PDI), potencial zeta (PZ) e pH em dois tempos: T0 (48 horas após a produção) e T65 (65 dias após a produção). As nanopartículas também foram avaliadas por fracionamento de fluxo assimétrico (AF4), por microscopia eletrônica de transmissão e atividade antioxidante frente ao EHP. Dentre as formulações avaliadas e condições de processo, os CLN-M4 BG apresentaram os melhores resultados: EET0 de 88,8%, EET65 de 63,7% e RP de 92,2. As formulações com F4 produzidas por HAP apresentaram EET0 de 97,5%, EET65 de 73,1% e RP de 32,8%. Todas as formulações produzidas apresentaram tamanho médio inferiores de 170 nm, distribuição monodispersa (≤ 0,3) e PZ acima de 30 mv. Adicionalmente, também apresentaram atividade antioxidante contra o EHP similar ao BHT, o que as torna promissoras como agentes antioxidantes para minimização dos processos oxidativos cutâneos e como sistema preventivo na formação do odor relativo a idade.Item Síntese e funcionalização de nanopartículas inalatórias e avaliação in vitro para tratamento de tuberculose.(2018) Carneiro, Simone Pinto; Santos, Orlando David Henrique dos; Fattal, Elias; Santos, Orlando David Henrique dos; Faraco, André Augusto Gomes; Rúbio, Karina Taciana Santos; Ferreira, Lucas Antônio Miranda; Cota, Renata Guerra de SáA tuberculose é uma doença bacteriana infecciosa considerada um grave problema de saúde pública, por ser classificada como a principal causa de morte no mundo por um único agente infeccioso. A OMS recomenda um protocolo de tratamento eficaz, porém, a terapia convencional requer a administração de altas doses diárias de cada medicamento pela via oral para uma resposta satisfatória do paciente, o que culmina na emergência de efeitos adversos graves, reduzindo a adesão à terapia. Neste contexto, o objetivo deste trabalho é sintetizar e funcionalizar nanopartículas inalatórias destinadas ao tratamento de tuberculose e avaliar, in vitro, suas propriedades físico-químicas, toxicidade e atividade biológica. O trabalho empregou estratégias distintas para o desenvolvimento de nanopartículas contendo fármacos antituberculosos. Uma das estratégias consistiu na aplicação de uma metodologia físico-química, em que carreadores lipídicos nanoestruturados de rifampicina foram obtidos pelo método da microemulsão. Esta nanoformulação foi funcionalizada com um peptídeo modificado baseado na sequência da tuftsina, o qual foi previamente sintetizado em fase sólida e, em seguida, acoplado à superfície das nanopartículas para vetorizar o carreador (NP-pRIF). As nanopartículas foram caracterizadas, confirmando a obtenção de um sistema de liberação monodisperso e estável. Os ensaios em cultura de células demonstraram que a NP-pRIF apresentou um potencial de internalização pelos macrófagos significativamente maior que as nanopartículas de rifampicina sem o peptídeo (NP-RIF). Os estudos de citotoxicidade constataram o potencial não-citotóxico de ambas as formulações (NP-pRIF e NP-RIF) em todas as concentrações testadas. Ainda, a eficácia da formulação foi testada frente ao Mycobacterium tuberculosis e apresentou uma concentração inibitória mínima 2 vezes menor que a requerida por uma solução do fármaco puro. Para viabilizar a administração pulmonar, as suspensões de nanopartículas foram acrescidas de manitol e submetidas à secagem por atomização por spray-drying, dando origem a um pó fino, fluido e caracterizado por microscopia eletrônica de varredura como micropartículas esféricas, com tamanho de partícula entre 2 – 10 μm. Os testes in vitro demonstraram o potencial de redispersão das micropartículas em água e liberação das nanopartículas alojadas em seu interior. A outra estratégia abordada neste trabalho envolveu o emprego de uma metodologia química para proceder à síntese de dois conjugados constituídos por um fármaco antituberculoso (rifampicina ou ácido pirazinoico) e o poli(ácido málico), através de reações de esterificação. Em seguida, os conjugados se auto-agregaram em água para a obtenção dos respectivos nanoconjugados (NC-RIF e NC-PA, respectivamente), confirmados pelas imagens de microscopia eletrônica de transmissão. Os testes em cultura de células demonstraram que ambos os nanoconjugados foram eficientemente internalizados pelos macrófagos e que as formulações não apresentaram potencial citotóxico para a maioria das concentrações testadas. Estas formulações serão futuramente secas em spray-drying para obtenção de micropartículas e viabilização da administração pulmonar. Em conclusão, ambas as estratégias empregadas neste trabalho foram eficientes na obtenção de nanocarreadores inovadores e com potencial para contribuição na otimização do tratamento da tuberculose.Item Proteômica quantitativa baseada em espectrometria de massas para estudo do trato alimentar de Schistosoma mansoni com ênfase na glândula esofagiana e suas secreções.(2018) Neves, Leandro Xavier; Borges, William de Castro; Wilson, R. Alan; Borges, William de Castro; Palmisano, Giuseppe; Castro, Ieso de Miranda; Cota, Renata Guerra de Sá; Marco, Ricardo deA esquistossomose é uma doença tropical negligenciada que afeta mais de 240 milhões de pessoas em 78 países. Apesar dos esforços para erradicação da doença, fatores como baixa cobertura dos programas de tratamento quimioterápico, métodos diagnóstico pouco sensíveis e reinfecções em regiões endêmicas, constituem desafios para o controle da transmissão. O desenvolvimento de vacinas contra schistosomas constitui uma ferramenta alternativa de combate à doença, porém, a identificação de antígenos protetores tem sido um grande desafio. Neste sentido, destaca-se o modelo de auto cura da infecção em macaco Rhesus (Macaca mulatta), no qual observa-se eliminação de parasitos após uma resposta humoral direcionada às interfaces do parasito, como tegumento e secreções da glândula esofagiana. Neste contexto, o presente trabalho teve como objetivo geral a caracterização proteômica em larga escala de produtos da glândula esofagiana e demais secreções do trato alimentar de S. mansoni para proposição de novos alvos vacinais. Uma abordagem quantitativa avaliou a presença de proteínas de interface em homogenato solúvel de vermes adultos, revelando uma baixa representatividade de moléculas de interesse nessa fração. A partir disso, um método de enriquecimento tecidual foi utilizado para a análise detalhada do esôfago de vermes machos adultos. As análises shotgun quantitativas apontaram 628 grupos de proteínas enriquecidos na região esofagiana, incluindo Microexon genes (MEG), hidrolases, glicosil transferases e proteínas para transporte vesicular. Ademais, essa abordagem permitiu a detecção de proteoformas de MEGs geradas por substituição e/ou deleção de resíduos de aminoácidos. Nove proteínas expressas na glândula esofagiana foram selecionadas para quantificação absoluta por QconCAT. A MEG-12 apresentou a maior concentração entre os alvos quantificados. A estimativa do número de cópias por célula das proteínas secretadas sugere que tais moléculas constituem alvos abundantes neste subproteoma. Por último, a caracterização proteômica do sobrenadante de cultura de S. mansoni resultou na detecção de um repertório expandido de proteínas do trato alimentar, incluindo MEGs esofagianas, reforçando a eventual exposição das secreções nessa interface parasito-hospedeiro. Em conjunto, as abordagens proteômicas de caracterização da região esofagiana e trato alimentar de S. mansoni resultaram na identificação de moléculas com potencial aplicação biotecnológica no desenvolvimento de vacinas, bem como alvos terapêuticos.Item Bioprospecção de bactérias de regiões de canga do Quadrilátero Ferrífero : estratégia de busca de alvos com potencial biotecnológico.(2018) Caneschi, Washington Luiz; Moreira, Leandro Marcio; Moreira, Leandro Marcio; Silva, Cynthia Canêdo da; Teixeira, Mônica Cristina; Almeida Junior, Nalvo Franco de; Silva, Silvana de QueirozO extrativismo mineral na região do Quadrilátero Ferrífero brasileiro destruiu grandes áreas de terra, dizimando espécies vegetais e sua microbiota associada. Pouco se sabe sobre a microbiota da região. Assim bactérias cultiváveis associadas a plantas e de solos foram investigadas por seu potencial biotecnológico. Amostras foram coletadas de nove espécies de plantas e seis amostras de solos, sendo 65 isolados bacterianos cultiváveis obtidos. Estes representam predominantemente bacilos gram-positivos (70%) capazes de produzir amilases (55%), proteases (63%), celulases (47%), ácido indolacético (AIA) (46%), sideróforos (26%) e solubilizar fosfato (9%). Além disso, 65% destes foram resistentes à ampicilina, 100% eram sensíveis à tetraciclina e 97% tolerantes a altas concentrações de arsênio. Três isolados foram estudados ainda: o isolado FOB3 (Rosenbergiella sp.) produziu altas concentrações de AIA in vitro na ausência de triptofano, demonstrado pela melhora na germinação de planta e taxa de crescimento onde o isolado estava presente. Os isolados C25 (Acinetobacter sp.) e FG3 (Serratia sp.), tiveram plasmídeos extraídos e inseridos em células de E. coli, onde modificaram o perfil fisiológico das cepas transformadas. A cepa E. coli :: pFG3B apresentou a maior capacidade de produção de biofilme, além de aumento na taxa de replicação, tolerância ao arsênio e atividade de catalase, além de aumentar a integridade do DNA na presença de arsênio. A cepa Serratia sp. teve seu genoma completo sequenciado pela plataforma PacBio sendo identificada como Serratia liquefaciens cepa FG3 (SlFG3). Foi identificado um cromossomo de 5,7 Mpb (5398 genes) e dois plasmídeos com 159 Kbp (179 genes) e 125 Kpb (146 genes). A análise comparativa do genoma de SlFG3 foi realizada com 33 outras espécies de Serratia com genomas completos e revelou a presença de 18 supostas inserções de fagos, permitindo identificar 311 genes únicos para o SlFG3 e um core genome de 417 famílias de proteínas. A análise filogenômica baseada no core genome permitiu agrupar SlFG3 em um clado com outras três linhagens de S. liquefaciens (FDAARGOS125, HUMV21 e ATCC27592) e Serratia proteamaculans 568 (Sp568), que compartilham um core de 3998 famílias de proteínas ortólogas. Entre esses cinco genomas, 75 genes são compartilhados apenas em SlFG3 e S. protemaculans 568, ambos isolados de plantas, e 643 famílias de proteínas são exclusivas de SlFG3. A análise desses genes revelou a presença de uma via completa relacionada à degradação de protocatecuato e compostos cloroaromáticos. Além disso, SlFG3 possui um repertório diversificado de genes associados a NRPs / PKS, um conjunto completo de síntese de celulose e metabolismo oxidativo completo e reparo de DNA. Finalmente, SlFG3 ainda possui genes relacionados à tiolação de RNA e DNA, inserida em uma região de fago que pode proteger os ácidos nucléicos contra diferentes condições de estresse. Esses achados resumem que o SlFG3 parece estar bem adaptada à diferentes situações de estresse impostas por condições extremas além de ser extremamente interessante no estudo de mecanismos molecularese composição gênica que pode ser melhor explorado com alto potencial biotecnológico.