PPBIOTEC - Mestrado (Dissertações)

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Desenvolvimento de ferramentas para elaboração de um banco de dados e análise da expressão de fatores de transcrição de soja (Glycine max) responsivos à ferrugem asiática.
(Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto., 2010) Soares, Zamira Guerra; Fietto, Luciano Gomes
Plantas infectadas com o fungo Phakopsora pachyrhizi, causador da doença ferrugem asiática, sofrem desfolhamento precoce acarretando grandes prejuízos para o agricultor. As formas de manejo da doença atualmente abrangem o vazio sanitário, o controle químico e utilização de cultivares resistentes. Como não existe um cultivar comercial imune os gastos com prevenção e manejo são muito elevados. Dentro deste contexto, o presente trabalho busca selecionar novos genes alvo para o desenvolvimento de um cultivar imune à doença, focando nos fatores de transcrição. Três bancos de dados de fatores de transcrição - SoybeanTFDB e o SoyDB, já existentes, e um desenvolvido neste trabalho (LBM) - foram comparados para a criação de um banco consenso, e dois softwares (BRa e Venn Diagram For Proteins) foram desenvolvidos para a sua construção (SoyLBM). O banco consenso SoyLBM abrange todas as sequências não redundantes dos três bancos possuindo 7202 sequências, 7,46% a mais do que o banco SoyDB e 30,09% a mais que o banco SoybeanTFDB. Após a criação do banco de dados foram identificados dezesseis genes candidatos a serem fatores de transcrição responsivos à ferrugem. Dentre eles, quatro tiveram sua expressão analisada por PCR em tempo real, em dois cultivares diferentes durante a infecção pelo fungo Phakopsora pachyrhizi. Dentre os genes analisados o fator MBF1B teve sua expressão aumentada em resposta à infecção, mas não apresentou diferença significativa de expressão entre os cultivares suscetível e resistente sugerindo que esteja ligado a uma resposta mais geral da planta a infecções. Os genes bZIPB, WRKYA e WRKYC mostraram aumento da expressão tardia no cultivar resistente em relação ao cultivar suscetível, sugerindo que estes genes são induzidos após o estabelecimento da infecção.
Aumento da resistência ao estresse oxidativo induzido pelo extrato hidroalcoólico de carqueja (Baccharis trimera) no Caenorhabditis elegans : seria através de um mecanismo SKN-1/p38 MAPK e DAF-16 dependente?
(Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto., 2011) Paiva, Franciny Aparecida; Oliveira, Riva de Paula
O alto consumo de comidas e bebidas ricas em flavonóides tem sido associado a um menor risco de doenças degenerativas crônicas como aterosclerose e câncer, devido tanto às suas atividades antioxidantes diretas de remoção de radicais livres, quanto à sua capacidade de atuar como antioxidante indireto ativando diferentes vias de sinalização em resposta ao estresse oxidativo. Baccharis trimera, conhecida como carqueja, é uma planta subarbustiva cujos extratos aquoso e hidroalcóolico são ricos em compostos antioxidantes tais como os ésteres do ácido quínico e os flavonóides nepetina, isoquercetina e quercetina. Recentemente, diversos estudos tem destacado as propriedades antioxidantes, anti-inflamatória, anti-proteolítica e anti-hemorrágica tanto em ensaios in vitro quanto in vivo. Neste projeto, nós investigamos o potencial antioxidante e pró-longevidade do extrato hidroalcóolico de carqueja (EHC) no organismo modelo Caenorhabiditis elegans. Para testar se o tratamento com o extrato hidroalcóolico de carqueja (EHC) aumenta a resistência ao estresse oxidativo, animais tipo selvagem foram tratados por 48 horas com 0,5, 5 e 50 mg/mL de EHC por 48 horas e depois submetidos ao estresse provocado por hidroperóxido de terc-butila (t-BOOH). O tratamento com 5 mg/ml aumentou significativamente a sobrevivência dos animais submetidos a 5 mM de t-BOOH. Embora o tratamento com 5 mg/ml por 48 horas ter aumentado a resistência ao estresse oxidativo, este mesmo tratamento não aumentou a resistência ao estresse térmico a 35 o C. O tratamento contínuo com 5 mg/ml de extrato de carqueja também não aumentou a longevidade dos animais tipo selvagem em condições normais. Apesar de apresentarem uma maior resistência ao estresse, os animais tratados com 5mg/ml do extrato de carqueja por 48 horas não apresentaram uma diferença significativa quanto aos marcadores bioquímicos (atividade da catalase) e indicadores de resistência (níveis de proteína carbonilada e sulfidrila totais) analisados em relação aos animais do grupo controle. Para averiguar se o aumento da resistência ao estresse oxidativo promovido pelo tratamento com extrato de carqueja depende da ativação dos fatores de transcrição SKN-1 e DAF-16, os ensaios de resistência ao estresse oxidativo foram repetidos usando mutantes de deleção ou “knockdown” para estes dois fatores. O tratamento com carqueja não aumentou a resistência ao estresse oxidativo dos mutantes skn-1(RNAi), sek-1 e daf-16. Por outro lado, também não foi observada a indução da localização nuclear nos animais tratados contendo gene repórter SKN-1::GFP e DAF-16::GFP. O presente trabalho sugere que EHC aumenta a resistência ao estresse oxidativo de uma maneira SKN/p38 MAPK e DAF-16 dependente. Porém, as análises de genes repórteres realizadas até o momento não corroboraram com estas observações.
Caracterização biológica, bioquímica e molecular em isolados de Leishmania infantum obtidos de cães naturalmente infectados : uma busca racional de biomarcadores de virulência e patogenicidade.
(Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto., 2011) Braga, Samuel Leôncio; Reis, Alexandre Barbosa
No Brasil, a Leishmaniose Visceral Canina (LVC) é causada por Leishmania infantum e os cães tem sido considerados como os principais responsáveis pela dispersão da doença. A LVC pode se manifestar com diferentes formas clínicas, variando desde uma infecção de caráter assintomático até uma forma sintomática grave, a qual na maioria das vezes culmina com a morte dos animais. O presente estudo empregou ferramentas biotecnológicas para avaliar características biológicas, bioquímicas e genéticas em dez cepas de Leishmania spp. isoladas de cães naturalmente infectados, portadores de diferentes formas clínicas (assintomática ou sintomática) da LVC, buscando identificar fenótipos de virulência e patogenicidade. Todos os isolados obtidos foram submetidos às seguintes avaliações: (i) comportamento em meio de cultivo (LIT); (ii) infectividade e patogenicidade mediante infecção experimental no modelo hamster (Mesocricetus auratus); (iii) análise bioquímica por meio de perfil de isoenzimas; (iv) identificação da espécie de Leishmania por PCR-RFLP; (v) RAPD-PCR para identificação de possíveis polimorfismos genéticos. Os resultados demonstram que os isolados de Leishmania obtidos de cães com ambas formas clínicas, apresentam fenótipos de crescimento diferenciados. Apesar da baixa taxa de infectividade obtida pela infecção experimental em hamster, foi possível selecionar dois isolados (I-3 e I-8), com diferentes potencias de infectividade quando comparados aos demais isolados e a cepa de referência L. infantum (MHOM/BR/74/PP75). As análises dos perfis enzimáticos (G6PD, IDH, GDH, MDH, ME e 6PGD), demonstraram que os isolados obtidos tanto de cães sintomáticos como assintomáticos apresentam padrões similares em relação ao número e migração das bandas eletroforética quando comparados com a cepa de referência de L. infantum. A PCR-RFLP demonstrou que nove isolados apresentaram perfil idêntico ao observado para cepa de referência de L. infantum, enquanto um isolado apresentou perfil semelhante ao da espécie L. amazonensis. Com o intuito de identificar características genéticas entre os isolados, que pudessem ser associadas com as formas clínicas da LVC foi empregada a técnica de PCR-RAPD. Os resultados obtidos permitiram a construção de um fenograma consenso gerado pelos iniciadores (M13-40F, QG1, L15995, K7, P53-1), demonstraram que maioria dos isolados apresentavam perfil genético semelhante ao da cepa de referência de L. infantum, sem diferenças significativas entre isolados obtidos de cães sintomáticos e assintomáticos. O conjunto de resultados obtidos no presente estudo vem contribuindo para um melhor entendimento das características biológicas, bioquímicas e genéticas de cepas de L. infantum oriundas de cães naturalmente infectados, portadores de diferentes formas clínicas da LVC.
Perfil de citocinas, linfócitos T e níveis de óxido nítrico em cães imunizados com as vacinas LBSap e LBSapSal e submetidos ao desafio experimental com Leishmania (Leishmania) chagasi e saliva de Lutzomyia longipalpis.
(Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto., 2011) Resende, Lucilene Aparecida; Giunchetti, Rodolfo Cordeiro
Os cães representam o reservatório doméstico mais importante de L. chagasi (sin. L. infantum), e uma vacina contra leishmaniose viscer al canina (LVC) pode ser uma importante ferramenta para o controle da leishmanio se visceral humana (LV). Além disso, para a obtenção de uma vacina efetiva, é fundamental o entendimento de eventos relacionados à imunogenicidade após a vacinação e desafio co m o agente etiológico para que seja definida a resposta imune associada à proteção contra a infecção por Leishmania. Assim, neste trabalho foi verificada a imunogenicidade e proteção conferida pela vacinação de cães contra LVC com os imunobiológicos LBSap e LBSapSal. Desta forma, trinta e cinco cães sem raça definida foram distribuídos em sete grupos experimentais, entre os quais: (i) grupo controle C (n = 5) que recebeu 1 mL de salina estéril a 0,9%; (ii) grupo LB (n = 5) que recebeu 600 μg de proteína de Leishmania braziliensis em 1 mL de salina estéril a 0,9%; (iii) grupo Sap (n = 5) que recebeu 1 mg de saponina em 1 mL de salina estéril a 0,9%; (iv) grupo LBSap (n = 5) que recebeu 600 μg de proteína de L. braziliensis associado a 1 mg de saponina em 1 mL de salina estéril a 0,9%; (v) grupo Sal (n = 5) que recebeu extrato de glândula salivar de Lutzomyia longipalpis (SGE) equivalente ao conteúdo de 5 ácinos da glândula salivar em 1 mL de salina estéril a 0,9%; (vi) grupo LBSal (n = 5) que recebeu 600 μg de promastigotas de L. braziliensis associado ao SGE em 1 mL de salina estéril a 0,9%; (vii) grupo LBSapSal (n = 5) que recebeu 600 μg de promastigotas de L. braziliensis associado a 1 mg de saponina e ao SGE em 1 mL de salina estéril a 0,9%. Cada animal recebeu três aplicações subcutâneas no flanco esquerdo em intervalos de quatro semanas. Posteriormente, os cães foram infectados por via intradérmica com 1x10 7 promastigotas de Leishmania (Leishmania) chagasi na presença de saliva de L. longipalpis, sendo avaliados 90 e 885 dias pós desafio. Os níveis de óxido nítrico (NO) e citocinas (IL-4, IL-10, TGF-, TNF-, IL-12, IFN-) foram avaliados em sobrenadantes de cultura de células mononucleares do sangue periférico (CMSP) após estímulo com antígeno solúvel vacinal (VSA) ou antígeno solúvel de L. chagasi (SLcA). O grupo LBSap apresentou altos níveis de IL-4 (T3 e T90dpd), IL-10 (885dpd) e baixos níveis de TGF- (885dpd) após estímulo com antígenos de Leishmania. Além disso, o grupo LBSapSal apresentou baixos níveis de IL-4 (90dpd) e TGF- (90 e 885dpd) após estímulo com antígeno de Leishmania. Adicionalment e, altos níveis de IL-12 foram observados nos grupos LBSap e LBSapSal (T3, 90dpd e 885dpd). Da mesma forma, aumento dos níveis de IFN- foram observados nos grupos LBSap (T3, 90dpd e 885dpd) e LBSapSal (T3, 90dpd e 885dpd). O perfil de citocinas sugere que as vacinas LBSap e LBSapSal podem conferir imunidade protetora contra a infecção por Leishmania. Os resultados obtidos a partir da análise dos níveis de NO confirmaram a hipótese de que as estas vacinas induzem um perfil de resistência contra a infecção por Leishmania. Os principais resultados do presente estudo apontam para uma forte imunogenicidade induzida pela vacinação de cães com LBSap e LBSapSal e submetidos ao desafio experimental com L. chagasi, indicando uma ação destes imunobiológicos compatível com controle do parasito em cães. Novos estudos de avaliação da carga parasitária em medula óssea através da PCR em tempo real podem fornecer importantes informações para um melhor entendimento da eficácia das vacinas LBSap e LBSapSal.
Caracterização de leveduras termotolerantes para produção de etanol celulósico.
(Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto., 2011) Costa, Daniela Arruda; Fietto, Luciano Gomes
A conversão de material lignocelulósico em açúcares fermentáveis é considerada uma alternativa promissora para aumentar a produção de etanol. Neste contexto tem sido demonstrado que maiores rendimentos em etanol são obtidos por meio do acoplamento das etapas de sacarificação e fermentação, processo chamado sacarificação e fermentação simultâneas (SSF). No entanto, um dos entraves do processo é a temperatura ótima para a realização das duas etapas; uma vez que, a ação ótima das celulases ocorre em torno de 50°C, e nquanto que a maioria dos organismos fermentativos cresce entre 30° e 37°C. Com o objetivo de viabilizar o processo SSF foi isolada e identificada uma linhagem termotolerante de Saccharomyces cerevisiae, denominada LBM-1. A fim de selecionar o microorganismo adequado e as condições ideais para a realização do processo SSF, foram comparadas linhagens de leveduras das espécies S. cerevisiae (LBM-1, CAT-1 e PE- 2) e Kluyveromyces marxianus (UFV-3, ATCC 8554 e CCT 4086), quanto à utilização de fonte de carbono, tolerância a etanol e termotolerância, por meio da análise do perfil de crescimento e dos valores da velocidade específica de crescimento. De posse dos dados de temperatura máxima suportada pelas linhagens testadas, foram realizados ensaios de fermentação para estabelecer a quantidade ideal de inóculo a ser utilizada. Estes ensaios foram realizados utilizando glicose como substrato e em duas temperaturas diferentes, nas quais as leveduras tiveram um bom crescimento. Sabendo-se a concentração ideal de inóculo a ser utilizada procedeu-se à análise comparativa do rendimento fermentativo das linhagens testadas em processo SSF utilizando o bagaço de cana de açúcar como substrato. O seqüenciamento da região D1/D2 do DNA ribossomal confirmou que o isolado LBM-1 é uma linhagem de levedura pertencente à espécie S. cerevisiae. Os experimentos realizados mostraram que as linhagens de S.cerevisiae são mais tolerantes ao etanol, enquanto que as linhagens de K. marxianus são mais termotolerantes. Além disso, as linhagens de S. cerevisiae LBM-1, CAT-1 e PE-2 são termotolerantes e possuem a capacidade de crescer e fermentar a 42°C. Por meio da caracteriza ção fisiológica, foram estabelecidas duas temperaturas para a realização dos ensaios de fermentação, 37° e 42°C, nas quais todas as linhagens apresentaram um bom crescimento. Desta forma, foram feitos experimentos de fermentação em glicose comparando duas densidades óticas iniciais a 600 nm (D.O.(600)), 0,1 e 2, para saber qual seria a D.O.(600) ideal para iniciar a fermentação. Os resultados mostraram que uma D.O.(600) mais alta, correspondente a 2, favorece um aumento no rendimento do processo. Ensaios de fermentação em glicose a 37°C apresentaram valores de rendimentos em etanol próximos ao teórico 0,51. Nos ensaios de SSF com bagaço de cana de açúcar realizados tanto a 37°C, quanto a 42°C, foram obtid os rendimentos muito similares. Entretanto, a 37°C houve uma maior concentração fin al em etanol do que a 42°C. Além disso, os ensaios de SSF juntamente com dados obtidos anteriormente pelo grupo comprovaram que a fermentação deve ser iniciada após 72 horas de préhidrólise, uma vez que neste tempo ocorre inibição das celulases pelo produto. Com isto pode-se concluir que todas as linhagens testadas podem ser utilizadas para viabilizar o processo SSF.
Utilização de resíduos da produção de biodiesel como base de meio de cultura para leveduras de interesse comercial.
(Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto., 2011) Bastos, Cristiana de Souza; Brandão, Rogélio Lopes
Em uma economia movida pelo transporte, a dinâmica dos combustíveis líquidos faz parte de sua engenharia. A mudança do consumo de energia baseado em combustíveis fósseis para os de fontes renováveis é um desafio e uma necessidade de ordem econômica e ambiental. Uma vez que o petróleo é a principal fonte fóssil utilizada e possui reservas de fácil acesso limitadas, o consumo destas irá eventualmente exaurir sua oferta. Uma alternativa que tem mostrado-se promissora nos últimos anos é o uso dos Biocombustíveis. Dentre estes, o maior destaque é dado ao Bioetanol e Biodiesel. A partir do processo produtivo de Biodiesel industrialmente utilizado são obtidos ésteres monoalquílicos de ácidos graxos (Biodiesel) e co-produtos dos quais o mais importante é o glicerol. Muitos microrganismos são capazes de utilizar o glicerol como única fonte de carbono, e um exemplo são as leveduras. O objetivo deste projeto foi desenvolver um processo, industrialmente vantajoso, para utilizar um co-produto de baixo custo da produção de Biodiesel como base para meio de cultura para diferentes leveduras. Utilizou-se três linhagens de interesse comercial, Saccharomyces cerevisiae LBCM 653C (produtora de cachaça) e do fermento de panificação FLEISHMANN, e S. boulardii, e uma linhagem laboratorial, S. cerevisiae BY4741. Cresceu-se essas linhagens em diluições de resíduo glicérico bruto de Biodiesel fornecido pelo CETEC (Centro Tecnológico de Minas Gerais/Belo Horizonte-MG) e pela BIOMINAS (Biominas Indústria e Comércio de Biodiesel LTDA/Itaúna-MG). As diluições foram acrescidas de diferentes fontes nitrogenadas (YP – Extrato de levedura e Peptona, Sulfato de Amônio e Uréia) e analisadas quanto ao crescimento celular. As preparações nas quais obteve-se crescimento celular similar àquele obtido em meio laboratorial YPGlicerol foi com o acréscimo de YP como fonte nitrogenada, e o crescimento celular em resíduo diluído com ou sem a adição Sulfato de Amônio e Uréia não foi apreciável quando comparado àquele obtido com YP. Análise dos dados mostrou que o crescimento celular em cada preparação de resíduo de Biodiesel diluído depende da linhagem utilizada. Sugere-se que a manutenção do pH em valores mais baixos estimule o crescimento celular em resíduo de Biodiesel diluído. Além disso, a estocagem parece promover modificações no resíduo que inibem o crescimento celular da linhagem S. boulardii sob as condições ensaiadas. Devido ao fato de que as leveduras estudadas foram capazes de crescer em diluições de resíduo de Biodiesel, a utilização deste em processo biotecnológico com leveduras é viável.
Fermentação consorciada leveduras/bactérias láticas aplicada à produção de cachaça como possibilidade de melhoria do padrão de qualidade.
(Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto., 2011) Carvalho, Bruna Trindade de; Brandão, Rogélio Lopes
Cachaça é a bebida destilada mais consumida no Brasil, e a terceira mais consumida no mundo. O Brasil exporta este produto para 45 países, porém estas vendas não atingem 1% da produção nacional. Para incrementar a exportação é necessário que se atinja um novo patamar de qualidade. Tal qualidade pode ser alcançada pela utilização de Lactato de etíla leveduras selecionadas, que permitem a obtenção de estabilidade físico-química e sensorial, além de incremento do “flavour” devido à maior produção de compostos voláteis, especialmente álcoois superiores e ésteres. Um importante éster, o lactato de etila, é descrito como tendo caráter frutado e habilidade de mascarar o sabor vegetal residual da cachaça. Ele é formado pela esterificação do etanol com ácido lático, produzido por bactérias láticas (LABs), que por sua vez são consideradas contaminantes do processo. O objetivo deste trabalho é investigar se é possível a utilização de bactérias láticas em fermentação mista, para a produção de cachaça de alto padrão de qualidade, devido ao incremento nos teores do éster lactato de etila. Este trabalho utiliza uma cepa de levedura Saccharomyces cerevisiae selecionada, a LBCM606, em associação a cada uma das quatro cepas bacterianas descritas entre os contaminantes mais comuns da fermentação da cachaça: Bacillus coagulans, Bacillus stearothermophilus, Lactobacillus plantarum e Lactobacillus fermentum, além da cepa isolada de Yakult® Lactobacillus casei Shirota, utilizada como controle industrial, e duas cepas isoladas de dorna, bLBCM680-2 e bLBCM680-3. As fermentações mistas foram comparadas à fermentação tradicional. Alíquotas da fermentação foram retiradas nos tempos de 0, 2, 4, 6, 8, 24 e 48h e analisadas quanto ao pH e consumo de sacarose, e nos tempos 0, 24 e 48h quanto à população de células. Tais análises não forneceram evidências de que bactérias até a concentração de 106 UFC/ml possam prejudicar o processo produtivo da cachaça devido ao consumo de açúcares e queda da viabilidade de leveduras provocada por acidificação do meio. A dosagem de lactato de etila foi realizada por CG-MS nos tempos de 8, 24 e 48h de fermentação, e revelam um desempenho superior das cepas isoladas de dorna e, principalmente, do controle industrial, L. casei. Estas três cepas testadas sob a condição de reciclo de células, mantém a viabilidade de células bacterianas apenas ao longo dos três primeiros ciclos, sendo que no décimo ciclo, a contagem de células viáveis é menor que 0,5% da contagem do primeiro ciclo. A cepa bLBCM680-2 por possuir uma produção de lactato de etila mais estável ao longo dos ciclos, é a mais promissora para a utilização em dornas de produção de cachaça.
Estudos genômicos de flexibilidade e energia livre associados à distribuição de SNPs.
(Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto., 2011) Oliveira, Luciana Márcia de; Weber, Gerald
Os SNPs (single nucleotide polymorphism) são mutações resultantes de uma substituição, inserção ou deleção que ocorrem em uma única base. Tais substituições são perpetuadas quando ocorrem erros de pareamentos (mismatch) que não são corrigidos. Existem dois tipos de substituição: transição, quando há trocas entre purinas (A e G) ou entre pirimidinas (C e T), e transversão quando há a substituição de uma purina por uma pirimidina ou vice-versa. Nós acreditamos que a ocorrência e distribuição desses eventos evolutivos nos genomas ocorrem em função da pressão biológica seletiva mas por outro lado também podem estar relacionadas às características físicas da microrregião onde eles acontecem. Neste trabalho, nós avaliamos a influência da energia livre e da flexibilidade da microrregião genômica em função da distribuição de SNPs em um genoma de procarioto e oito genomas de eucariotos. Como as bases vizinhas tem um papel importante na ocorrência desses eventos, analisamos as perturbações locais que um mismatch promove na estrutura do DNA levando em consideração a composição das bases imediatamente adjacentes ao erro. Para tanto, recuperamos da base de dados dbSNP (release 132) as sequências depositadas de nove organismos as quais foram classificadas de acordo com a presença de transição ou transversão nos seus genomas. A metodologia descrita na literatura para o cálculo dos valores de energia livre e flexibilidade de dois pares de bases foi extrapolada para a avaliação dessas propriedades em uma microrregião composta por três pares de bases contendo um mismatch central. Nossos resultados indicam que para certos organismos, como por exemplo Apis Mellifera , existe uma correlação quase linear entre a ocorrência de SNPs e a energia livre. É também possível constatar que os SNPs ocorrem preferencialmente em regiões do DNA cujas faixas de valores de energia livre são altas. Por outro lado, nossos resultados também evidenciam que a flexibilidade de uma microrregião interfere na ocorrências dos SNPs, uma vez que a maioria desses eventos tendem a ocorrer em regiões mais rígidas quando comparadas às regiões de pareamentos canônicos do DNA. Finalizando, ao correlacionar a energia livre e as flexibilidades, observamos que para genomas como os de mamíferos as transições tendem a ocorrer mais frequentemente em microrregiões mais estáveis e rígidas da molécula ao passo que as transversões são frequentes em microrregiões menos estáveis, porém rígidas do DNA.
Avaliação dos efeitos antioxidantes e pró-longevidade do extrato de açaí (Euterpe oleraceae Mart.) no organismo modelo Caenorhabditis elegans
(Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto., 2011) Nunes, David Silva; Oliveira, Riva de Paula
O alto consumo de comidas e bebidas ricas em flavonóides tem sido associado com o menor risco de doenças degenerativas crônicas como aterosclerose e câncer devido tanto às suas atividades antioxidantes diretas de remoção de radicais livres, quanto à sua capacidade de atuar como antioxidante indireto ativando diferentes vias de sinalização contra o estresse oxidativo. O Euterpe oleracea Mart. ou açaizeiro é uma palmeira nativa das regiões amazônicas cuja fruta é rica em flavonóides, especialmente em antocianinas e proantocianidinas (cianidina-3-glicosídeo e cianidina-3-rutinosídeo). Recentemente, diversos estudos têm destacado as propriedades antioxidantes, pró-apoptóticas, antiproliferativas e pró-longevidade do açaí, tanto em ensaios in vitro quanto em modelos animais. Neste trabalho, o Caenorhabditis elegans foi utilizado como organismo modelo para testar as atividades antioxidantes in vivo de diferentes extratos de açaí que possam ser exploradas para aumentar as defesas inatas ao estresse oxidativo e a longevidade. Através do método do pH diferencial, foi verificado que a quantidade de antocianinas presentes nos dois extrato de açaí liofilizado (AL-1 e AL-2) apresentaram em torno de 19,2 a 34,7 mg de antocianinas monoméricas/100g de extrato. Para testar se o tratamento com os extratos de açaí liofilizado (AL-1 e AL-2) aumentam a resistência ao estresse oxidativo, animais tipo selvagem foram tratados por 48 horas do estágio larval L1 até L4 com 100 e 200 mg/ml de extrato de açaí e depois submetidos ao estresse provocado por hidroperóxido de terc-butila (t-BOOH). Animais tratados com 200 mg/ml não se desenvolvem e permanecem em L1. Já os animais selvagens tratados com 100 mg/ml de AL-1 e AL-2 foram mais resistentes ao estresse oxidativo provocado por 5 mM de t-BOOH do que os animais não tratados. Por outro lado, o tratamento dos animais tipo selvagem com 100 mg/ml de AL-1 por 168 horas não aumentou a resistência ao estresse térmico a 35oC. O tratamento contínuo com 100 mg/ml de AL-1 também não aumentou a longevidade dos animais tipo selvagem. Apesar de apresentarem uma maior resistência ao estresse, os animais tratados com 100mg/ml do extrato de açaí por 48 horas não apresentaram uma diferença significativa quanto aos marcadores bioquímicos (atividade da catalase) e indicadores de resistência (proteína carbonilada e sulfidrila totais) em relação aos animais do grupo controle. Para verificar se o aumento da resistência ao estresse oxidativo promovido pelo tratamento com extrato de açaí depende das vias de sinalização p38/SKN-1 e DAF-16, os ensaios de resistência ao estresse oxidativo foram repetidos usando mutantes de deleção sek-1(ku7), a p38 MAPKK, skn-1(RNAi) e daf-16(mgDf46). Aparentemente, o tratamento com 100 mg/ml AL-1 não aumentou a resistência ao estresse oxidativo dos mutantes sek-1 e daf-16, sugerindo que este aumento depende da ativação de SEK-1 e DAF-16. Por outro lado, não foi observada a indução da localização nuclear nos animais tratados contendo gene repórter DAF-16::GFP. Estes dados sugerem que o aumento da resistência ao estresse oxidativo induzido pelo tratamento com extrato de açaí possivelmente depende da p38 MAPK e DAF-16, porém sem ocorrer ativação da localização nuclear de DAF-16.
O papel da e-NTPDase de Leishmania nos processos de adesão, internalização e modulação da resposta em macrófagos.
(Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto., 2011) Gomes, Rodrigo Saar; Afonso, Luís Carlos Crocco
As NTPDases são enzimas com a habilidade de hidrolisar nucleotídeos di e trifosfatados sob estímulo de íons bivalentes (Ca2+ ou Mg2+) e são caracterizadas pela presença de regiões altamente conservadas (ACR1 a ACR5). A maior parte dessas enzimas é encontrada ligada à membrana e são conhecidas como ecto-nucleotidades. São encontrados em inúmeros tipos celulares, incluindo protozoários, como parasitos do gênero Leishmania. Possuem importante papel na modulação da resposta imune devido à hidrólise de ATP, conhecida molécula inflamatória, e consequente acúmulo de adenosina, pela ação subsequente da 5’-nucleotidase na quebra de AMP, que, por sua vez, estimula resposta antiinflamatória. Sabe-se, ainda, do importante papel das NTPDases no processo de adesão e internalização de parasitos em células hospedeiras. O presente trabalho teve por objetivo avaliar o papel das e-NTPDases de Leishmania nos processos de adesão, internalização e modulação da resposta em macrófagos. Macrófagos provenientes do peritônio de camundongos C57BL/6 foram infectados com L. amazonensis tratados com anticorpos anti-NTPDase, e os resultados demonstraram redução na porcentagem de células contendo parasitos aderidos após 30 minutos. Além disso, competição com e-NTPDase recombinante reduziu a adesão e internalização de parasitos aos macrófagos. A modulação da expressão dessas enzimas através do tratamento com adenina ou suramina no parasito também altera esses parâmetros. De forma interessante, nas células que foram infectadas, o número de parasitos por célula é o mesmo nos diferentes grupos, sugerindo que populações diferentes de macrófagos possam ter níveis diferenciados de expressão de receptores desconhecidos pra e-NTPDase. Para análise de modulação da resposta macrofágica, células foram incubadas com e-NTPDase recombinante (rNTPDase). Os dados demonstram redução na produção de óxido nítrico (NO) por células tratadas com rNTPDase. Além disso, observou-se redução de citocinas como IL-10, IL-12 e aumento de TGF-β, demonstrando que a ligação de e-NTPDase de Leishmania é capaz de modelar as diferentes funções do macrófago. E, por fim, observou-se que células tratadas com rNTPDase perdem, após 30 minutos, a capacidade fagocítica. Conclui-se, portanto, que a e-NTPDase de Leishmania é uma importante molécula de adesão e consequente internalização do parasito pelos macrófagos e que essa ligação é capaz de alterar o padrão de resposta dessas células, sendo indicativo de que a e-NTPDase é mais uma molécula de superfície de Leishmania envolvida na subversão da resposta imune contra o parasito, e, consequentemente, no favorecimento da infecção.
Atividade citotóxica de fungos endofíticos associados à Clusia arrudae Planchon & Triana (Clusiaceae).
(Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto., 2012) Silva Filho, Antonio Cesar Corrêa; Rosa, Luiz Henrique
Os fungos são organismos capazes de sobreviver isoladamente ou em relações simbióticas com outros organismos. Nos tecidos vegetais os fungos colonizam espaços intracelulares de plantas sem causar dano aparente ao seu hospedeiro, os quais são chamados de endofíticos e por colonizar estes espaços e apresentar constante interação com seu hospedeiro, estes fungos são capazes de produzir diferentes metabólitos bioativos. O câncer, ainda hoje, é uma doença que acomete milhares de pessoas ao redor do mundo. A busca por novos compostos com atividade antitumoral, principalmente oriundos direta ou indiretamente de vegetais, são importantes para obtenção de tratamentos mais eficazes e com menos efeitos colaterais. Neste estudo, 30 exemplares de Clusia arrudae Planchon & Triana tiveram suas folhas e caules coletados e inoculados em placas de Petri contendo meio Agar Dextrosado Batata (BDA) para isolamento dos seus fungos endofíticos associados. Um total de 100 isolados de fungos, agrupados em 21 morfotipos, foram obtidos; destes 63 do caule e 37 das folhas. Os fungos obtidos foram submetidos à extração etanólica de seus metabólitos, os quais foram avaliados quanto à capacidade de inibir as linhagens tumorais humanas HUTU (HTB-40) e RKO (CRL-2579), bem como uma linhagem humana normal WI26VA4 (CCL-951). As linhagens celulares foram expostas aos extratos dos 41 fungos endofíticos nas concentrações de 240, 120, 60 e 30 μg/mL (p/v) e tiveram sua morfologia analisada por microscopia utilizando sondas fluorescentes para identificação do núcleo, citoesqueleto e viabilidade celular. Os ensaios de citotoxicidade, considerando a Concentração Inibitória (CI50), demonstraram que oito extratos apresentaram atividade sobre as linhagens celulares analisadas; ao ampliar a linha de corte para CI55, quatro extratos apresentaram tendência à toxicidade. Os fungos produtores de extratos bioativos foram identificados por meio do sequenciamento da região ITS do rDNA gene. Os extratos dos fungos Pleosporales sp. UFMGCB 5502, Pleosporales sp. UFMGCB 5467, Pleosporales sp. UFMGCB 5485, Xylaria sp. UFMGCB 5500 e Pleosporales sp. UFMGCB 5498. apresentaram toxicidade sobre a linhagem normal de pulmão WI26VA4. Dos extratos que apresentaram toxicidade, apenas o extrato do fungo Pleosporales sp. UFMGCB 5502 também apresentou atividade antitumoral para a HUTU, juntamente com Pleosporales sp. UFMGCB 5478 e Pleosporales sp. UFMGCB 5533. Para linhagem RKO, somente o extrato do fungo Pleosporales sp. UFMGCB5460 exerceu citoxicidade. Considerando o valor de CI55, os fungos UFMGCB 5534, UFMGCB 5539, UFMGCB 5508 UFMGCB 5489 mostraram toxicidade para todas as linhagens. Os fungos que causam citoxicidade para a célula RKO foram predominantemente isolados dos caules e para a célula HUTU das folhas, independente do morfotipo encontrado. Os fungos obtidos das folhas causaram quebra do citoesqueleto e as células permaneceram vivas quando analisadas pelo kit de viabilidade celular. Já os fungos obtidos do caule causaram aglutinação e perda de adesão celular e indicio de morte. A partir destes resultados podemos concluir que a comunidade de fungos endofíticos associados a C. arrudae são capazes de produzir metabólitos com atividade citotóxica em linhagens tumorais humanas in vitro e alguns extratos também se mostraram tóxicos para células normais.
Metodologia para ensaios de candidatos vacinais contra leishmaniose visceral canina pelo co-cultivo de linfócitos e macrófagos infectados com Leishmania chagasi.
(Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto., 2012) Viana, Kelvinson Fernandes; Giunchetti, Rodolfo Cordeiro
Nos últimos 30 anos, a leishmaniose visceral (LV) tem avançado para áreas urbanas e periurbanas, apontando o cão como principal reservatório da L. chagasi (sin. L. infantum). Neste contexto, pesquisadores consideram como consenso que uma vacina contra a leishmaniose visceral canina (LVC) poderia ser uma importante ferramenta no controle tanto da leishmaniose humana como canina. Por esta razão, foi desenvolvido um novo método para avaliar o sistema imune de cães que poderia ser empregado como uma alternativa para se analisar imunogenicidade e níveis de proteção em candidatos vacinais contra a LVC. Para tanto, foram empregadas células mononucleares do sangue periférico CMSP de cães saudáveis para padronização de: (i) condições in vitro de cultivo de monócitos diferenciados em macrófagos de cães (MD-MC) infectados previamente com L. chagasi e avaliados após 3, 24, 48, 72 e 96h da infecção nos tempos de 2, 3, 4 e 5 dias de diferenciação do MD-MC (n=5 cães saudáveis); (ii) purificação de subpopulações de células T (CD4+ e CD8+) considerando a razão de linfócitos:macrófagos variando de 1:5 a 2:1 (n=12 cães saudáveis). Em todos os experimentos foram utilizados sobrenadante de cultura para analisar diferentes biomarcadores imunológicos, tais como: níveis de óxido nítrico, a produção de mieloperoxidase (MPO) e N-acetilglicosaminidase (NAG); citocinas do tipo 1 (IFN-, TNF-, IL-12), tipo 2 (IL-4) e imunomodulatórias (IL-10); e avaliada a frequência do parasitismo e carga parasitária em MD-MC infectados com L. chagasi. Os resultados revelaram que após 5 dias da diferenciação do MD-MC e 72h da infecção por L. chagasi foi observado um melhor perfil morfológico e da habilidade microbicida. Apesar dos níveis de NAG permanecerem praticamente inalterados, a análise do MPO revelou redução significativa no tempo de cinco dias de diferenciação dos MD-MC, indicando a baixa contaminação por granulócitos neste período. Os experimentos de co-cultivo empregando MD-MC e subpopulações de células T mostrou um perfil marcante nos biomarcadores imunológicos e na atividade microbicida, considerando a razão de linfócitos (CD4+ ou CD8+) : macrófagos de 1:2 e 1:1:1 de linfócitos (CD4+ e CD8+) : macrófagos. Assim, nestas condições do co-cultivo foi observado associação entre a produção de óxido nítrico e os níveis de citocinas do tipo 1, tipo 2 e imunomodulatórias com a manutenção de uma frequência de parasitismo intermediária e estabilização da carga parasitária em MD-MC infectados por L. chagasi. Os dados obtidos com a realização deste trabalho estimulam a continuidade dos estudos empregando esta metodologia de MD-MC co-cultivados com células T CD4+ e/ou CD8+ provenientes de CMSP de cães imunizados com candidatos vacinais contra LVC.
Peptídeos antigênicos indutores de anticorpos específicos para identificação de alterações de maior prevalência do subtipo 2B da doença de von Willebrand e do fator de von Willebrand normal.
(2012) Paro, Marina de Oliveira; Andrade, Milton Hércules Guerra de
A doença de Von Willebrand (DVW) é um distúrbio hemorrágico hereditário de caráter autossômico dominante ou recessivo, ocasionado por defeitos quantitativos ou qualitativos do fator de Von Willebrand (FVW). Trata-se da coagulopatia hereditária mais comum na população humana, com prevalência de 1,3% da população. Os defeitos qualitativos são divididos em quatro subtipos (2A, 2B, 2M e 2N) de acordo com a alteração da função do FVW. A classificação dos diversos tipos de DVW se apóia em vários métodos de avaliação da função e da quantidade do FVW, o que dificulta esse diagnóstico tornando-o passível de erros. Diante das dificuldades atuais para o diagnóstico da DVW relacionadas às alterações qualitativas do FVW, esse trabalho apresenta como proposta o emprego de estratégias bioquímicas para a identificação de alterações na estrutura do FVW. Para se desenvolver métodos de isolamento do FvW que utilizem pequenos volumes de amostras de sangue para preparação de amostras para espectrometria de massas, alíquotas de plasma humano passaram por processo de precipitação por etanol e foram tratadas em colunas de gelatina para remover a fibronectina do FVW para isolá-lo como único componente em uma banda de 250 KDa, visando reduzir a possibilidade de supressão provocada por impurezas na espectrometria de massas. Mediante a análise da estrutura cristalográfica, com auxílio de ferramenta computacional, foram definidos 22 peptídeos correspondentes a sequência de aminoácidos encontradas no FVW normal e alterado presentes na DVW tipo 2A, 2B e 2M. Esses peptídeos foram utilizados na obtenção de anticorpos a partir da imunização de camundongos e na purificação dos mesmos em colunas de afinidade. Obtiveram-se quatro preparações anticorpos purificadas para alterações do tipo 2B com prevalência de 90%, além de três preparações de anticorpos purificados para o FVW normal. A obtenção desses anticorpos específicos para o FVW permitirá o uso dos mesmos em análises de multímeros no teste de diagnóstico, atualmente empregado na classificação de DVW, ensaios de capacidade de ligação ao fator VIII e produção de anticorpos monoclonais específicos.
Perfis de flexibilidade de regiões promotoras de organismos eucariotos.
(2012) Lima, Denise Fagundes; Weber, Gerald
Em uma sequência de DNA, a ativação de um gene está relacionada com a capacidade dos fatores de transcrição (TFs) em reconhecer um região específica do DNA denominada de região promotora. Apesar da existência dos promotores “core-less” (conhecidas por não conter elementos regulatórios), em eucariotos esta região é caracterizada por possuir vários elementos regulatórios na porção núcleo do promotor: São eles: TATA-box, Iniciador (INR), elemento posterior do promotor (DPE), elemento de reconhecimento do TFIIB e as ilhas CpGs. A busca por TSS (do inglês, transcription start site) e promotores é um passo importante para entender como funciona a regulação gênica e, por isso, muitos programas computacionais têm sido desenvolvidos. Além das características biológicas, alguns programas são construídos com base nos parâmetros físicos dos promotores como, por exemplo, a flexibilidade do DNA. Em geral, as técnicas experimentais utilizam sequências curtas (n-mer) para medir os parâmetros físicos e os valores encontrados para estas pequenas sequências são combinadas para representar uma sequência maior. A maneira fisicamente correta de combinar os parâmetros de flexibilidade é através da soma inversa dos valores de elasticidade de cada n-mer, de forma similar ao que ocorre em uma associação de molas em série, entretanto, a maioria dos trabalhos simplesmente somam estes valores. Diante disso, nós desenvolvemos e aplicamos um modelo de soma inversa da flexibilidade em sequências promotoras “core-less” e não “core-less” de eucariotos e construímos perfis de flexibilidade média onde avaliamos a utilização de diversos tamanhos de n-mer. Nós vimos que, em geral, a porção downstream ao TSS apresenta-se mais rígida do que a porção usptream ao TATA-box e a posição em torno de -28 ´e uma das regiões mais flexíveis. Nossos resultados também mostraram que a média da flexibilidade não é um boa estratégia para buscar por promotores e que, dependendo do tamanho do n-mer empregado, a frequência de cada valor de flexibilidade apresenta-se diferente. Ainda neste trabalho, nós analisamos a relação do conteúdo CG dos genes de microRNAs (miRNAs) e mirtrons de invertebrados e vertebrados e comparamos com as suas vizinhanças genômicas na tentativa de compreender a biogênese dos mirtrons. Mirtrons são um tipo especial de miRNA que se originam do mecanismo de splicing do pri-miRNA em vez de ser processado pela Drosha (enzima que cliva na haste do hairpin do pri-miRNA). Nós descobrimos que os mirtrons de invertebrados, até agora sem exceção, têm menor CG conteúdo do que suas regiões vizinhas. A partir deste resultado, nós sugerimos que o splicing que ocorre na biogênese dos mirtrons se deve ao mesmo motivo do splicing que ocorre durante a processamento do mRNA.
Alterações hepatoesplênicas associadas à infecção por Schistosoma mansoni no modelo murino.
(2012) Campos, Jonatan Marques; Borges, William de Castro
A Esquistossomose é uma doença endêmica em vários países, afligindo mais de 207 milhões de pessoas no mundo. É considerada a segunda infecção parasitária mais importante em termos de saúde pública devido ao impacto socio-econômico, podendo ocasionar cerca de 200 mil mortes anualmente. A caracterização do genoma e transcriptoma do Schistosoma mansoni propiciou o emprego de técnicas na área da proteômica as quais vem permitindo maior compreensão da biologia deste parasito em todos os estágios de seu ciclo de vida. Entretanto, até o momento, poucos estudos proteômicos abordaram a relação parasito-hospedeiro. O entendimento desta relação é de fundamental importância para a proposição de novos métodos de diagnóstico, avaliação de prognóstico e tratamento da doença. O presente trabalho teve como foco a análise das alterações no proteoma solúvel de fígado e baço, utilizando o modelo murino de infecção por S. mansoni. A primeira abordagem fundamentou-se na discriminação dos estágios de fase aguda e fase crônica nos animais infectados. Após realização do exame parasitológico de fezes, avaliação das alterações hepatoesplênicas através da relação (% órgão/corpo) e histologia de fígado e baço, foi possível estabelecer que o grupo de animais com 5 semanas de infecção desenvolveu a fase aguda da esquistossomose e animais infectados por 7 semanas apresentaram a fase crônica da doença. A técnica de eletroforese bidimensional comparativa, para proteínas solúveis de fígado e baço de animais controles e infectados, demonstrou alterações nos níveis de expressão de proteínas associadas com processos e vias bioquímicas diversas, como resposta ao estresse celular, tradução, ciclo da uréia e via glicolítica. No fígado, a categoria de proteínas chaperoninas apresentou maior número de representantes com alteração de expressão dentre as quais se destacam GRP-78 (proteína reguladora de glicose 78 kDa), HSP-71 (proteína de choque térmico 71 kDa), Erp-60 (calreticulina) e PDI (proteína dissulfeto isomerase). Por outro lado, proteínas como a CPSase I (carbamoil fosfato sintetase I), albumina, indoletilamina N-metiltransferase, peroxirredoxina-6 e anidrase carbônica III apresentaram expressão diminuída no fígado em decorrência da infecção. O perfil proteômico do fígado do animal infectado correlacionou-se com a análise histológica do órgão na qual se observa uma intensa resposta imune celular. No baço, as proteínas identificadas com alteração de expressão foram calreticulina, fosfoglicerato quinase I, frutose-bifosfato aldolase A, gliceraldeído 3 fosfato desidrogenase, EF-Tu, (fator de elongamento) e aspartato aminotransferase. Em geral, as proteínas diferencialmente presentes no baço de animais infectados apresentaram aumento de expressão, sendo o perfil molecular compatível com a demanda de produção de energia e síntese proteica. Estes dois processos são altamente relevantes para o custeio da intensa proliferação celular observada no órgão. Coletivamente, os resultados obtidos demonstraram que a abordagem proteômica empregada permitiu a identificação de marcadores teciduais induzidos pela infecção por S. mansoni. Abordagens futuras permitirão estabelecer se as alterações teciduais decorrentes da infecção pelo parasito alteram significativamente o proteoma plasmático a ponto de indicar novos biomarcadores da esquistossomose.
Diversidade e bioprospecção de fungos associados às macroalgas antárticas Monostroma hariotti Gain e Porphyra endiviifolia (A. Gepp & E.S Gepp) Y. M. Chamberlain.
(Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto., 2012) Furbino, Laura Esteves; Rosa, Luiz Henrique
A produção de metabólitos bioativos por fungos marinhos têm sido alvo de grande interesse por diferentes grupos de pesquisa, uma vez que os oceanos cobrem mais de 70% da superfície da Terra e constituem um ambiente relativamente pouco explorado em relação à diversidade biológica e química das comunidades microbianas. Os estudos sobre fungos associados às macroalgas antárticas são escassos e muitas das espécies algícolas são endêmicas e/ou adaptadas a essa região, podendo constituir uma fonte atrativa de novas espécies e metabólitos de interesse biotecnológico. Os gêneros Porphyra C. Agardh e Monostroma Thuret incluem espécies de grande importância econômica, utilizadas na indústria alimentícia, cosmética e farmacêutica em vários países. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi conhecer a diversidade de fungos associados às macroalgas Monostroma hariotti Gain e Porphyra endiviifolia (A. Gepp & E.S Gepp) Y.M. Chamberlain ao longo de um gradiente latitudinal em ilhas antárticas e avaliar o potencial destes fungos em relação à produção de metabólitos com atividade biológica. As macroalgas foram coletadas nas Ilhas Elefante, Rei George e Deception. Para isolamento dos fungos foram coletados fragmentos de 390 espécimes de macroalgas. As amostras foram obtidas em substratos rochosos localizados na região entre marés. Para o isolamento dos fungos foram utilizados fragmentos dos talos das algas, os quais foram inoculados em placas de Petri contendo o meio Agar Marinho. No total foram obtidos 278 isolados de fungos; destes, 149 fungos filamentosos e 129 leveduras. Os isolados foram agrupados em morfoespécies a partir das características macromorfológicas e confirmados posteriormente por meio da técnica molecular de microsatélite utilizando o iniciador GTG’5. Um representante de cada morfoespécie foi identificado por meio de sequenciamento de regiões ITS e dos domínios D1/D2 do gene do rRNA para os fungos filamentosos e leveduras, respectivamente. As espécies identificadas pertencem aos gêneros Antarctomyces, Aspergillus, Cadophora, Candida, Cystofilobasidium, Cryptococcus, Geomyces, Guehomyces, Meyerozyma, Metschnikowia, Oidiodendron, Penicillium, Rhodotorula e Verticillium. Os estudos de diversidade indicaram que a composição da comunidade fúngica das macroalgas são pouco similares e, também, que as espécies fúngicas apresentam baixa especificidade quanto ao hospedeiro. Todos os fungos obtidos foram cultivados em Agar marinho para obtenção dos extratos brutos, os quais foram avaliados quanto a atividade antimicrobiana utilizando como alvo os micro-organismos: Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Candida albicans, C. krusei e Cladosporium sphaerospermum. Dos 218 extratos avaliados, oito apresentaram atividade antimicrobiana; destes, seis contra C. krusei, um contra C. albicans e um contra C. sphaerospermum. O extrato do fungo Geomyces pannorum UFMGCB 5987 apresentou atividade antimicrobiana considerada promissora (95,2%) frente aos esporos de C. sphaerospermum. Além dos ensaios antimicrobianos os fungos foram avaliados quanto à capacidade de degradar amido, carboximetilcelulose, xilana, proteína (caseína) e éster. Setenta e um por centos dos isolados apresentaram pelo menos um tipo de atividade enzimática, sendo a esterásica predominante (68%), seguida pelas atividades amilásica (43%), proteásica (38%), celulolítica (13%) e xilanolítica (0,16%). Os resultados obtidos neste trabalho sugerem a presença de uma comunidade de fungos adaptada às condições extremas da Antártica, a qual pode exercer um papel ecológico significativo na decomposição de matéria orgânica e na ciclagem de nutrientes; além disso, alguns destes fungos podem representar uma fonte promissora de metabólitos bioativos de interesse biotecnológico.
Análise proteômica do secretoma de Leishmania infantum e ensaios preliminares para a descoberta de biomarcadores da Leishmaniose visceral canina.
(Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto., 2012) Soares, Micheline; Borges, William de Castro
As leishmanioses constituem um grupo heterogêneo de doenças que abrangem áreas tropicais e subtropicais, sendo endêmicas em 88 países com aproximadamente 12 milhões de infectados e 350 milhões de pessoas expostas ao risco. Por ano, cerca de 1.500.000 casos de leishmaniose tegumentar e 500.000 casos de leishmaniose visceral (LV) são relatados. Os cães, os principais reservatórios domésticos, são considerados o principal elo na cadeia de transmissão da LV. A partir da disponibilidade dos dados de sequenciamento dos genomas de algumas espécies de Leishmania (L. major, L. infantum e L. braziliensis), ferramentas na área da proteômica podem ser empregadas para a identificação de novas proteínas com potencial para o diagnóstico, prognóstico e/ou o desenvolvimento de vacinas contra a leishmaniose. O foco do presente estudo constituiu a caracterização molecular do secretoma da espécie L. infantum, utilizando-se de uma abordagem proteômica. Promastigotas em fase log de crescimento foram submetidos ao cultivo sob duas condições experimentais. A primeira, nas condições normais de cultivo de promastigotas (pH 7.2 e temperatura de 26ºC) e, para a segunda, utilizando condições para mimetizar o microambiente de um fagolisossomo (pH 5.5 e temperatura de 35ºC). A homogeneidade do secretoma foi avaliada a partir da contagem de parasitos viáveis, durante diferentes tempos de cultivo, empregando marcação por iodeto de propídeo e citometria de fluxo. A técnica de marcação revelou que durante 8h de cultivo a percentagem de parasitos viáveis manteve-se aproximadamente 94%. A fração do sobrenadante de cultura, obtido durante 6h em pH 7.2, foi submetida à digestão em solução utilizando tripsina. Os peptídeos resultantes foram separados usando cromatografia de fase reversa e detectados para fragmentação a partir de uma interface acoplada ao espectrômetro de massas operando via electrospray. Após busca de homologia em bancos de dados foram identificadas 135 proteínas, as quais foram classificadas em 9 categorias funcionais e 1 hipotética. Dados sobre abundância relativa permitiram concluir que o secretoma de L. infantum está representado por basicamente três categorias (1) metabolismo de nucleotídeos, (2) metabolismo de carboidratos e (3) outros processos. Sessente e três proteínas foram submetidas à análises de bioinformática para predição de sinais moleculares indicativos de secreção, por meio de vias clássicas e não clássicas. Cerca de 50% das proteínas investigadas são potencialmente secretadas, das quais, 30% atingem o meio extracelular por vias não clássicas. Soros de animais naturalmente infectados, portadores de diferentes formas clínicas da LVC, foram utilizados para testar a imunogenicidade associada aos secretomas de L. infantum e L. amazonensis. Experimentos de Western blotting mostraram que ambas as preparações são úteis na identificação de animais portadores de LVC. Além disso, as mesmas frações podem ser utilizadas na discriminação de animais sintomáticos, daqueles portadores de outras formas clínicas da doença. Coletivamente, a caracterização molecular do secretoma de L. infantum e os ensaios preliminares de imunoproteômica abriram novas possibilidades de investigação relacionadas ao tratamento, prognóstico e diagnóstico da LVC.
Síntese de peptídeos ricos em prolina e arginina e atividade inibitória sobre o complexo proteolítico proteassoma 20s de mamíferos e do parasito Schistosoma mansoni.
(Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto., 2012) Breguez, Gustavo Silveira; Andrade, Milton Hércules Guerra de
O proteassoma tem sido considerado um potencial alvo farmacológico devido ao seu envolvimento em processos vitais relacionados à proteólise celular, sendo a mais importante entre as vias de degradação. Recentemente, foi demonstrado que moléculas análogas ao peptídeo PR-11(RRRPRPPYLPR), que corresponde aos 11 primeiros aminoácidos da porção N-terminal do peptídeo PR-39, apresentam uma forte inibição sobre o proteassoma humano 20S, inibindo a atividade quimotripsina-símile em concentrações namolares (nM). Os peptídeos dessa classe desempenham importantes atividades anti-inflamatórias e angiogênicas. Novas moléculas envolvendo substituições conservativas de aminoácidos e sínteses de peptídeos cíclicos podem ser derivadas dessas estruturas, com o intuito de se encontrar melhores inibidores. Dessa forma, este trabalho teve como objetivos a síntese do peptídeo PR-11 e análogos para a realização de ensaios de atividade peptidásica in vitro, visando verificar o potencial inibitório dos peptídeos sintetizados em frações enriquecidas com proteassoma 20S de fígado de camundongos Swiss, eritrócitos humanos e vermes adultos de Schistosoma mansoni. Os peptídeos foram sintetizados empregando-se a estratégia Fmoc em fase sólida, purificados em sistema HPLC e identificados por espectrometria de massas. As frações com proteassoma 20S foram obtidas a partir de cromatografias de filtração molecular em Sephacryl S-400, as quais permitiram preparar satisfatoriamente enriquecidos de proteassoma livres de proteases de baixa massa molecular. Todos os análogos foram capazes de inibir a atividade quimotripsina-símile in vitro do proteassoma 20S das três espécies estudadas, utilizando a concentração final de 1μM de peptídeo. De um modo geral, as intensidades das atividades inibitórias foram similares para o proteassoma 20S de camundongos e humanos e menores para o de vermes adultos de Schistosoma mansoni. Os análogos cíclicos C8C15 e C9C15, quando comparados ao PR-11, apresentaram menor atividade sobre o proteassoma de humanos e atividade similar quanto à inibição em Schistosoma mansoni. Tal fato sugere que esse tipo de alteração estrutural possa ser útil na busca por inibidores mais seletivos para o proteassoma 20S do parasito.
Análise da imunogenicidade e eficácia empregando-se as vacinas LBSap, Leishmune®, Leish-Tec® em uma plataforma de testes in vivo.
(2013) Mendonça, Ludmila Zanandreis de; Giunchetti, Rodolfo Cordeiro
É consenso que a estratégia mais racional para o controle da leishmaniose visceral, que tem como agente etiológico a Leishmania chagasi (sinonímia L. infantum), seria o emprego de uma vacina que proteja o cão impedindo o seu papel de reservatório doméstico do parasito. Assim, considerando o camundongo como modelo experimental amplamente utilizado em ensaios pré-clínicos vacinais anti-Leishmania, é de extrema importância analisar, neste modelo, candidatos vacinais de forma pareada e simultânea. Neste sentido, este projeto avaliou um ensaio pré-clínico vacinal, para análise comparativa de aspectos relacionados a imunogenicidade e eficácia dos candidatos vacinais contra leishmaniose visceral, entre os quais: Leish-Tec® (LT), Leishmune® (LM) e vacina LBSap (composta de antígeno bruto de L. braziliensis e saponina). Dessa forma, camundongos BALB/c foram imunizados com três doses de cada vacina e, após trinta dias da última dose vacinal, os animais foram desafiados experimentalmente com promastigotas de L. chagasi. Trinta dias após o desafio, os animais foram submetidos a eutanásia. Nos tempos antes da 1° dose vacinal (T0), 14 dias após a 3° dose (T1) e antes da eutanásia (T2), amostras de sangue foram coletadas do plexo orbital para realização do leucograma e avaliação do perfil imunofenotípico, ex vivo, de leucócitos circulantes. O baço e o fígado foram coletados no tempo T2 para avaliação da carga parasitária pela técnica de PCR em tempo real. Os resultados obtidos indicam que todas as vacinas são incócuas e seguras para a administração. Dentre as principais alterações relacionadas ao estabelecimento de mecanismos imunoprotetores destaca-se o aumento dos níveis de células NK CD3-CD49b+ observado em T2 para os diferentes grupos vacinais (LT, LM, LBSap). Além disto, ao se avaliar a imunidade adaptativa, foi observado no grupo LT aumento de linfócitos T totais CD3+ em T2, que pode ser associado ao aumento da subpopulação de linfócitos T CD3+CD4+ no mesmo período. De forma interessante, a imunização com vacina LBSap induziu aumento da população de linfócitos T totais CD3+ tanto após o protocolo vacinal (T1) como após o desafio experimental (T2). Este aumento relatado no grupo LBSap parece ser reflexo da expansão da população de linfócitos T CD4+ nos mesmos tempos (T1 e T2). Semelhantemente, o grupo LM apresentou este mesmo perfil de reposta imune com aumento de linfócitos T CD4+ tanto em T1 como em T2. Este perfil imunofenotípico parece ter favorecido o controle do parasitismo tecidual tanto no baço como no fígado para as diferentes vacinas avaliadas. Neste contexto, foi observada redução da carga parasitária esplênica de 36% (LT), 63% (LM) e 42% (LBSap). Além disto, a análise da carga parasitária hepática revelou redução do parasitismo de 48% (LT), 71% (LM) e 62% (LBSap). Estes resultados parecem indicar o estabelecimento de mecanismos imunoprotetores pelos diferentes imunobiológicos avaliados, compatível com a redução da carga parasitária no baço e figado de camundongos imunizados com as vacinas LT, LM e LBSap. Buscando ampliar a identificação de biomarcadores associados a indução de imunoproteção, será realizada como perspectiva a dosagem de imunoglobulinas anti-Leishmania (IgG, IgG1, IgG2a e IgG2b), bem como a análise do perfil de citocinas.
Identificação de proteínas microbianas produzidas durante a digestão anaeróbia de matéria orgânica.
(Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto., 2013) Zorel, José Augusto; Silva, Silvana de Queiroz; Borges, William de Castro
No decorrer do tratamento biológico de efluentes, junto à degradação de poluentes os micro-organismos produzem diferentes biomacromoléculas (BMM) que diminuem a qualidade do efluente. Dentre eles, destacam-se as substâncias poliméricas extracelulares (EPS) e os produtos microbianos solúveis (SMP). Apesar da importância desses compostos no desempenho do tratamento, sua caracterização molecular (origem e composição) é ainda incipiente. Nesse sentido, esse trabalho tem como objetivo analisar proteínas envolvidas na degradação anaeróbia de matéria orgânica. Para a análise de proteínas SMP produzidas durante o crescimento microbiano (associadas à utilização do substrato - UAP), foram testadas seis diferentes condições operacionais variando substrato, razão alimento/micro-organismo e temperatura. Quanto à fração dos SMP associada à fase endógena (BAP), o substrato foi omitido. O sobrenadante dos ensaios foi coletado e suas proteínas caracterizadas. Com o intuito de identificar a origem das proteínas encontradas em solução (se provenientes de lise celular ou hidrólise de EPS), foram extraídas proteínas intracelulares e da matriz extracelular. Todas as amostras foram submetidas à separação por SDS-PAGE e/ou identificação por LC-MS/MS. Os perfis de bandas apresentados pelas amostras de EPS mostram que a grande maioria é comum a todos os extratos e que essas apresentam, em geral, alta massa molecular. Entre as proteínas SMP, apesar de existirem proteínas comuns a todos os ensaios, nota-se as proteínas liberadas parecem ser relacionadas com as condições externas. A comparação das amostras supracitadas com proteínas oriundas de lise celular permitiu sugerir que proteínas SMP de baixa massa molecular seriam possivelmente originadas da hidrólise de EPS. Quanto às proteínas identificadas, entre os SMP, foram encontrados indicativos da presença de proteínas originadas de lise celular (proteína de camada S, proteíno-quinase e proteína ribossomal). Quanto às amostras de extratos celulares, foram identificadas proteínas relacionadas à aderência celular (MrkA, OmpA), responsáveis pela mobilidade celular (flagelina) e envolvidas na degradação de substratos (glicerol-desidrogenase). Muitos dos espectros obtidos, apesar de apresentarem perfil típico de fragmentação de peptídeos, não retornaram resultados positivos, evidenciando a necessidade da construção de bancos de dados genômicos para amostras naturais. Dentro de nosso conhecimento, esse é o primeiro trabalho a identificar proteínas SMP, mostrando aplicabilidade de técnicas proteômicas para o entendimento da microbiologia de sistemas de tratamento biológico.

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