Cota, Renata Guerra de SáHangai, Nilza Satie2013-04-022013-04-022007HANGAI, N. S. Efeito do PSI na inibição do proteassoma 20S de Trypanosoma cruzi. 2007. 87 f. Dissertação (Mestrado em Ciências Biológicas) - Universidade Federal de Ouro Preto, Ouro Preto, 2007.http://www.repositorio.ufop.br/handle/123456789/2687As proteases dos parasitos protozoários têm recebido um foco especial nas últimas décadas como potenciais alvos terapêuticos. Uma delas, o proteassoma 20S, é uma protease compartimentalizada que tem um papel crucial na biologia celular, regulando vários processos, dentre eles, a degradação de proteínas de meia vida curta, a progressão do ciclo celular e a apresentação de antígenos. Neste sentido, este trabalho teve como objetivo geral avaliar o padrão de expressão e a atividade peptidásica desta protease, bem como o impacto da inibição do proteassoma com PSI, um inibidor clássico da atividade quimotripsina, na proliferação in vitro e na evolução da infecção experimental de camundongos Swiss inoculados com as cepas Y, Berenice-62 e Berenice-78 de Trypanosma cruzi. A análise por RT-PCR, utilizando oligonucleotídeos específicos para as subunidades catalíticas do proteassoma 20S (semelhantes à caspase, tripsina e quimotripsina), RNA total das formas epimastigotas obtidas das cepas Y, Be-62 e Be- 78, e do gene hipoxantina-guanina fosforibosiltransferase como normalizador, mostraram níveis equivalententes de mRNA para estas subunidades. Por outro lado, utilizando a técnica de Western blot e anticorpos específicos para as subunidades do tipo alfa (1, 2, 3, 5, 6 e 7), foi evidenciada uma maior abundância de proteassoma 20S na cepa Be-78 quando comparada às cepas Y e Be-62. Estas diferenças nas quantidades absolutas de proteassoma foram confirmadas pela medida das respectivas atividades peptidásicas, utilizando susbtratos específicos e uma fração enriquecida de proteassoma. Os nossos resultados confirmam a atividade tripsina como a principal em epimastigota de T. cruzi e também sugerem que esta protease pode ser regulada por mecanismos póstranscricionais. A seguir, para a avaliação do efeito da inibição do proteassoma na replicação das formas epimastigota ao meio LIT contendo 3x106 parasitos, foram adicionadas concentrações que variaram entre 0,033 a 50μM de PSI. Foi observada uma redução da proliferação de 90% para as cepas Y e Be-78 quando comparados aos grupos controles. Entretanto, a cepa Be-62 apresentou uma redução da proliferação de 57% na concentração de 0,033μM e de 73% na concentração de 0,083μM. Esses resultados sugerem que um proteassoma funcional é essencial para a replicação das formas epimastigotas. Posteriormente, estes parasitos foram analisados por microscopia eletrônica de varredura. Foi observado o desligamento do corpo celular do parasito do seu flagelo, rugosidade acentuada em suas membranas celulares, bem como deformações na parte anterior do corpo celular, sugerindo que a inibição do proteassoma induz um desequilíbrio no turnover das proteínas envolvidas na manutenção do corpo do parasito. Finalmente foi analisado o efeito da inibição do proteassoma na evolução da infecção experimental da Doença de Chagas. Inicialmente, os tripomastigotas sanguíneos foram incubados com 100μM de PSI durante 20 minutos e posteriormente 5x103 parasitos foram inoculados em camundongos Swiss. Foi observada uma redução do número de parasitos de 68%, 42%, 73% no pico de parasitemia das cepas Y, Be-62 e Be-78, respectivamente. Esses resultados corroboram as diferenças bioquímicas iniciais observadas entre o proteassoma destas cepas. A análise do parasitismo tecidual e do processo de inflamação no baço, fígado músculo cardíaco e esquelético mostrou que na cepa Y o grau de parasitismo dos camundongos infectados com tripomastigotas pré-incubadas com PSI foi maior quando comparado ao grupo controle, porém, com um processo inflamatório que não acompanhou este quadro. Entretanto, quando foi utilizada a cepa Be-62, foi observado um aumento acentuado do parasitismo no fígado e baço acompanhados por uma exacerbação do processo inflamatório, quando comparado ao grupo controle. Este padrão não foi observado para a cepa Be-78, que apresentou comparada ao grupo controle, uma manutenção do padrão de parasitismo tecidual bem como do processo inflamatório. Em conjunto, nossos dados sugerem que o proteassoma é essencial para a manutenção do ciclo biológico do T. cruzi, uma vez que a inibição desta protease na fase replicativa (epimastigota), além de bloquear o ciclo celular, induz alterações morfológicas, enquanto que uma inibição na fase infectiva, compromete a progressão da infecção experimental.pt-BRTrypanosoma cruzi - genomaProtozoologiaTripanossomose - tratamentoBiologia molecularDissertacao