Caracterização das subunidades catalíticas do proteassoma 20S em cepas de Trypanosoma cruzi susceptíveis e resistentes ao benzonidazol.

Abstract

A doença de Chagas é causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi. Segundo a WHO existem 16-18 milhões de pessoas infectadas com este protozoário na América Latina. Devido ao envolvimento do proteassoma na biologia celular do T. cruzi e a baixa eficiência das drogas utilizadas no tratamento de indivíduos com doença de Chagas, entendemos que a caracterização das subunidades catalíticas do proteassoma 20S, poderá ajudar no desenvolvimento de futuros quimioterápicos contra essa doença. Neste sentido, este trabalho mostra a caracterização molecular e bioquímica das subunidades catalíticas do proteassoma 20S em um padrão de cepas do T. cruzi com sensibilidade e resistência induzida “in vitro” ao benzonidazol (17WTS e 17LER), sensibilidade e resistência selecionada “in vivo” ao benzonidazol (BZS e BZR) e cepas naturalmente sensíveis e resistentes a essa droga (CL e Colombiana, respectivamente). As análises de localização cromossômica utilizando a técnica de eletroforese em gel de campo alternado, mostraram vários perfis de hibridização, sugerindo que estes genes não estão associados com o fenótipo de resistência do T. cruzi a drogas. Além disso, utilizando a técnica de Southern blot, mostramos que estes genes estão presentes em no mínimo duas cópias por genoma haplóide do parasito. A expressão desses genes foi avaliada através da técnica de Northern blot e os níveis do proteassoma 20S identificados utilizando Western blot e anticorpos contra subunidades alfa. Podemos constatar que enquanto os níveis de mRNA não variaram entre as cepas, uma maior quantidade de proteassoma 20S foi detectado nas cepas sensíveis (17WTS, BZS e CL) quando comparado as cepas resistentes (17LER, BZR e Colombiana). Além disso, também não detectamos acúmulo de conjugados poliubiquitinados, sugerindo que o processo de poliubiquitinação e degradação de proteínas intracelulares dependente do proteassoma 26S são fortemente regulados no padrão de cepas de T. cruzi estudadas. A medida da atividade peptidásica utilizando substratos específicos para as subunidade Beta-1, -2 e -5, mostraram uma atividade peptidásica principal semelhante à tripsina em todas as cepas analisadas, entretanto, as cepas 17WTS e 17LER também apresentaram uma alta atividade peptidásica semelhante à quimotripsina. Os resultados obtidos até o momento, sugerem que modificações póstraducionais são mais eficientes na função do proteassoma 20S do que a regulação ao nível transcricional ou pós-transcricional, na forma epimastigota do T. cruzi.