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Title: Nanofarmacologia na leishmaniose visceral empregando uma mistura de lipossomas convencionais e peguilados com antimoniato de meglumina e vacinas.
Authors: Reis, Levi Eduardo Soares
metadata.dc.contributor.advisor: Reis, Alexandre Barbosa
Roatt, Bruno Mendes
Keywords: Quimioterapia
Imunoquimioterapia
Issue Date: 2017
metadata.dc.contributor.referee: Reis, Alexandre Barbosa
Marques, Marcos José
Andrade, Hélida Monteiro de
Lana, Marta de
Mosqueira, Vanessa Carla Furtado
Citation: REIS, Levi Eduardo Soares. Nanofarmacologia na leishmaniose visceral empregando uma mistura de lipossomas convencionais e peguilados com antimoniato de meglumina e vacinas. 2017. 133 f. Tese (Doutorado em Ciências Farmacêuticas) - Escola de Farmácia, Universidade Federal de Ouro Preto, Ouro Preto, 2017.
Abstract: Os antimoniais pentavalentes são fármacos de 1ª escolha no tratamento das leishmanioses no Brasil. Em virtude dos vários efeitos colaterais do tratamento, a associação do fármaco em lipossomas poderia aumentar a adesão e a eficácia terapêutica. Sendo assim, o objetivo deste estudo foi avaliar diferentes protocolos de tratamento aplicados à leishmaniose visceral (LV) experimental empregando uma mistura de lipossomas convencionais e peguilados com antimoniato de meglumina e a sua associação com as vacinas LBSap e LBMPL. Para avaliação da quimioterapia com as formulações lipossomais, foram utilizados camundongos BALB/c (n=12/grupo), divididos nos seguintes grupos experimentais: (i) infectados e tratados apenas com solução salina (PBS); (ii) infectados e tratados com a mistura de lipossomas convencionais e peguilados vazios (Lip V); (iii) infectados e tratados com antimoniato de meglumina na forma livre - 20 mg/kg (AM) e (iv) infectados e tratados com a mistura de lipossomas convencionais e peguilados contendo antimoniato de meglumina - 20 mg/kg (AML). Após o tratamento os animais foram submetidos à infecção experimental com 1x107 promastigotas de L. infantum, em fase estacionária de crescimento, por via endovenosa. Os camundongos receberam uma dose única do tratamento no 14o dia pós-infecção (d.p.i) e a eutanásia foi realizada no 28o d.p.i. A formulação lipossomal consistiu na mistura de lipossomas convencionais - DSPC, CHO e DCP e lipossomas peguilados - DSPC, CHO, DCP e 2000-DSPE-PEG. As caracterizações físico-químicas das formulações lipossomais demonstraram uma taxa de encapsulação do fármaco de 20,5% e 30,6% para as formulações lipossomais convencionais e peguiladas, respectivamente. A mistura das formulações lipossomais convencionais e peguiladas apresentaram um diâmetro médio de 229 nm e uma liberação estável do fármaco em 24 horas. Para avaliação da resposta compartimentalizada em relação ao tratamento com lipossomas, foi avaliada de forma quantitativa a presença de células inflamatórias no fígado. Foi observada uma diminuição significativa do processo inflamatório nos grupos tratados com antimoniais (AM e AML) e ausência de granulomas hepáticos nos animais do grupo AML. A estimulação in vitro de esplenócitos com antígeno solúvel de L. infantum (ASLi) revelou um aumento significativo de linfócitos T CD8+ produtores de IFN-γ e uma redução nos linfócitos T CD4+ e T CD8+ produtores de IL-10 apenas no grupo AML. Além disso, os animais do grupo AML apresentaram um aumento na razão IFN-γ/IL-10 para os linfócitos T CD4+ e T CD8+ específicos. Quando avaliada a eficácia do tratamento, foi observada uma positividade na detecção de DNA do parasito no baço de 41,7%, 50,0%, 25,0% e 0,0% para os grupos PBS, Lip V, AM e AML, respectivamente. Já no compartimento hepático, a positividade foi de 83,3%, 100,0%, 83,3% e 41,4% para os grupos PBS, Lip V, AM e AML respectivamente, demonstrando assim, a eficácia obtida com a formulação lipossomal peguilada do antimoniato. Uma alternativa para melhorar a eficácia da terapêutica convencional é o uso da imunoterapia atuando no reestabelecimento do sistema imune, sendo esta utilizada isoladamente ou em associação com a quimioterapia (imunoquimioterapia). Dessa forma, nós avaliamos em um protocolo de imunoquimioterapia (lipossomas + vacinas), a capacidade de indução de memória imunológica nos animais infectados. Foram utilizados camundongos BALB/c (n=12/grupo), divididos nos seguintes grupos experimentais: (i) infectados e tratados com antígeno de L. braziliensis (LB); (ii) infectados e tratados com a vacina LBMPL (LBMPL); (iii) infectados e tratados com a vacina LBSap (LBSap); (iv) infectados e tratados com a associação da vacina LBMPL e a mistura de lipossomas convencionais e peguilados contendo antimoniato de meglumina (LBMPL+AML); e (v) infectados e tratados com a associação da vacina LBSap e a mistura de lipossomas convencionais e peguilados contendo antimoniato de meglumina (LBSap+AML). A infecção foi realizada com 1x107 promastigotas de L. infantum, em fase estacionária de crescimento, por via endovenosa. O esquema terapêutico utilizando vacinoterapia foi realizado com três doses vacinais no 28º, 35º e 42º d.p.i e a formulação lipossomal foi administrada em dose única no 35º d.p.i. No 49o d.p.i foi realizada a eutanásia dos animais para análise dos fenótipos de memória central (CD62Lhi CD44hi CD27hi CD197hi) e efetora (CD62Llow CD44hi) em esplenócitos estimulados com ASLi. Foi demonstrado que a associação imunoquimioterápica da vacina LBMPL+AML induziu um maior percentual de células de memória central em linfócitos T CD4+ e T CD8+. Já a associação da vacina LBSap+AML induziu uma resposta imunológica de memória efetora na subpopulação de linfócitos T CD4+. Dessa forma, o conjunto de resultados obtidos neste trabalho permite concluir que o emprego da quimioterapia com a nanoformulação composta por uma mistura de lipossomas convencionais e peguilados contendo antimonial é promissora no tratamento da LV. Este protocolo quimioterápico foi capaz de diminuir o processo inflamatório, impedir o comprometimento da arquitetura hepática e induzir a polarização de uma resposta imune do tipo 1 (Th1), associada a redução da carga parasitária em órgãos-alvo (baço e fígado). Além disso, a avaliação imunológica da imunoquimioterapia pela associação da formulação lipossomal com a vacinoterapia, demonstrou resultados relevantes por induzir a estimulação de células de memória central (LBMPL+AML) e efetora (LBSap+AML). Portanto, as formulações lipossomais compostas pela mistura de lipossomas convencionais e peguilados contendo antimoniato de meglumina são excelentes alternativas para o tratamento da LV, tanto isoladamente quanto em combinação com a vacinoterapia.
metadata.dc.description.abstracten: Pentavalent antimonials are drugs of first choice in the treatment of leishmaniasis in Brazil. Due to various side effects of standard treatment, the liposome drug combination could increase the acceptance and therapeutic efficacy. The objective of this study was to evaluate different treatment protocols applied to experimental visceral leishmaniasis (VL) using a mixture of conventional and pegylated liposomes with meglumine antimoniate and its association with LBSap and LBMPL vaccines. For the evaluation of chemotherapy with the liposomal formulations, BALB/c mice were used (n =12/group), divided into the following experimental groups: (i) infected and treated with saline solution (PBS); (ii) infected and treated with the mixture of conventional and pegylated liposomes (Lip V); (iii) infected and treated with meglumine antimoniate in free form - 20 mg/kg (AM) and (iv) infected and treated with the mixture of conventional and pegylated liposomes containing meglumine antimoniate; 20 mg/kg (AML). After treatment the animals were submitted to experimental infection with 1x107 promastigotes of L. infantum, in stationary phase of growth, by intravenous route. Mice received a single dose of treatment on the 14th day post infection (d.p.i) and euthanasia was performed on the 28th d.p.i. The liposomal formulation consisted of mixing conventional liposomes - DSPC, CHO and DCP and pegylated liposomes - DSPC, CHO, DCP and 2000-DSPE-PEG. The physico-chemical characterization of the liposomal formulations demonstrated a 20.5% and 30.6% drug encapsulation rate for conventional and pegylated liposomal formulations, respectively. The mixture of the conventional and pegylated liposomal formulations had a mean diameter of 229 nm and a stable release of the drug in 24 hours. The presence of inflammatory cells in the liver was quantitatively evaluated to assess the compartmentalized response to liposome treatment. A significant decrease in the inflammatory process was observed in the groups treated with antimonials (AM and AML) and absence of hepatic granulomas in the animals of the group AML. In vitro stimulation of splenocytes with soluble L. infantum antigen (ASLi) revealed a significant increase in IFN-γ-producing CD8+ T lymphocytes and a reduction in IL-10 producing CD4+ and CD8+ T lymphocytes only in the AML group. In addition, animals in the AML group showed an increase in the IFN-γ/IL-10 ratio for specific CD4+ and CD8+ T lymphocytes. Regarding the efficacy of the treatment, the spleen DNA detection showed a positivity 41.7%, 50.0%, 25.0% and 0.0% for the PBS, Lip V, AM and AML groups, respectively. In the hepatic compartment, the positivity was 83.3%, 100.0%, 83.3% and 41.4% for the PBS, Lip V, AM and AML groups respectively, thus it demonstrated an efficacy obtained with the formulation liposomal antimoniate. An alternative to improve the efficacy of conventional therapy is the use of immunotherapy by acting on the reestablishment of the immune system, which is used alone or in combination with chemotherapy (immunochemotherapy). Thus, we evaluated in an immunochemotherapy protocol (liposomes + vaccines) the ability to induce immune memory in infected animals. In this protocol, BALB/c mice (n =12/group) were used, divided into: (i) infected and treated with L. braziliensis antigen (LB); (ii) infected and treated with the LBMPL vaccine (LBMPL); (iii) infected and treated with the LBSap vaccine (LBSap); (iv) infected and treated with combination of the LBMPL vaccine and the mixture of conventional and pegylated liposomes containing meglumine antimoniate (LBMPL+AML); and (v) infected and treated with the association of the LBSap vaccine and the mixture of conventional and pegylated liposomes containing meglumine antimoniate (LBSap+AML). The infection was performed with 1x107 promastigotes of L. infantum, in stationary phase of growth, by intravenous route. The therapeutic regimen using vaccinotherapy was performed with three vaccine doses at 28th, 35th and 42th d.p.i and the liposomal formulation was administered as a single dose at 35th d.p.i. At the 49th day, the animals were euthanized to analyze the central (CD62Lhi CD44hi CD27hi197hi) and effector (CD62Llow CD44hi) memory phenotypes in ASLi-stimulated splenocytes. The immunochemotherapy association of the LBMPL+AML vaccine induced a higher percentage of central memory cells in CD4+ and CD8+ T lymphocytes. The association of the LBSap+AML vaccine induced an effector memory phenotypein the subpopulation of CD4+ T lymphocytes. Thus, the set of results obtained in this work allows to conclude that the use of chemotherapy with the nanoformulation composed by a mixture of conventional and pegylated liposomes containing antimonial is promising in the treatment of VL. This chemotherapeutic protocol was able to reduce the inflammatory process, prevent hepatic architecture impairment and induce the polarization of a type 1 (Th1) immune response, associated with reduction of parasite load on target organs (spleen and liver). In addition, the immunological evaluation of immunochemotherapy by the association of the liposomal formulation with the vaccinotherapy, showed relevant results by inducing stimulation of central (LBMPL+AML) and effector (LBSap+AML) memory cells. Therefore, liposomal formulations composed of the mixture of conventional and pegylated liposomes containing meglumine antimoniate are excellent alternatives for the treatment of VL, either alone or in combination with the vaccinotherapy.
Description: Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas. CIPHARMA, Escola de Farmácia, Universidade Federal de Ouro Preto.
URI: http://www.repositorio.ufop.br/handle/123456789/9497
metadata.dc.rights.license: Autorização concedida ao Repositório Institucional da UFOP pelo autor, 06/02/2018, com as seguintes condições: disponível sob Licença Creative Commons 4.0, que permite copiar, distribuir e transmitir o trabalho, desde que seja citado o autor e licenciante. Não permite a adaptação desta.
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