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Title: Do leishflow ao leishplex : inovações tecnológicas da sorologia por citometria de fluxo aplicada ao diagnóstico da Leishmaniose Visceral Canina.
Authors: Ker, Henrique Gama
metadata.dc.contributor.advisor: Reis, Alexandre Barbosa
Carvalho, Andréa Teixeira de
Keywords: Leishmania
Diagnóstico
Sorologia
Issue Date: 2016
metadata.dc.contributor.referee: Reis, Alexandre Barbosa
Pascoal, Vanessa Peruhype Magalhães
Silva, Eduardo Sérgio da
Veloso, Vanja Maria
Silva, Glenda Nicioli da
Citation: KER, Henrique Gama. Do leishflow ao leishplex : inovações tecnológicas da sorologia por citometria de fluxo aplicada ao diagnóstico da Leishmaniose Visceral Canina. 2016. 121 f. Tese (Doutorado em Ciências Farmacêuticas) - Universidade Federal de Ouro Preto, Ouro Preto, 2016.
Abstract: Os ensaios sorológicos para Leishmania são determinantes para indicar a eutanásia de cães como medida de controle da Leishmaniose Visceral no Brasil. No presente estudo, buscou-se avaliar o desempenho das metodologias sorológicas que atualmente são – e os que já foram – adotadas pelo Ministério da Saúde do Brasil (DPP, ELISA e RIFI), assim como o da sorologia por Citometria de Fluxo (CF), no diagnóstico da Leishmaniose Visceral Canina (LVC). Os ensaios foram conduzidos em uma ampla variedade de amostras de soro, que incluiu cães naturalmente infectados por Leishmania infantum portadores de diferentes formas clínicas, cães infectados com outras protozooses caninas (L. braziliensis, Trypanosoma cruzi, Ehrlichia canis e Babesia canis) e cães vacinados contra LVC (Leishmune®, Leish-Tec® e LBSap). Em relação aos testes oficiais, o principal achado se deu pela elevada especificidade do DPP (99,4%) em relação à ELISA (89,9%) e RIFI (75,2%). Quanto ao teste LeishFlow, destacou-se a sensibilidade de 95,0% tanto nos cães assintomáticos, quanto nos oligossintomáticos e sintomáticos. A especificidade do LeishFlow em amostras de soro de cães infectados por L. braziliensis foi de 80,0%, 55,6% nas amostras de T. cruzi, 93,3% em E. canis, e 100,0% em B. canis. Nos cães vacinados pela Leishmune®, Leish-Tec® e LBSap observou-se 100,0% de especificidade. A sequência do trabalho buscou o desenvolvimento de uma inovação metodológica na sorologia por CF por meio do acoplamento de antígenos recombinantes à microesferas de poliestireno. Os antígenos multiepitopo PQ20 e C1, e os recombinantes rLci1A e rLci2B foram acoplados a diferentes microesferas, formando os sistemas antigênicos microesfera–proteína C6–PQ20, E7–C1, A4–rLci1A, e E4–rLci2B. Constatou-se que os sistemas A4−rLci1A e E4−rLci2B foram os únicos que se mostraram adequadamente funcionais para a pesquisa de anticorpos caninos IgG. O ensaio sorológico pelo sistema A4−rLci1A apresentou sensibilidade de 85,0% nos cães assintomáticos, e 95,0% nos oligossintomáticos e sintomáticos. A especificidade deste sistema nos cães infectados por L. braziliensis foi de 100,0%, enquanto que nas infecções por E. canis e B. canis, esse valor foi de 30,0% e 20,0% respectivamente. Nos cães vacinados por Leishmune® e Leish-Tec® a especificidade foi de 70,0%, e por LBSap de 80,0%. O sistema antigênico E4−rLci2B, por sua vez, apresentou sensibilidade de 85,0% nos animais assintomáticos, e de 100,0% nos oligossintomáticos e sintomáticos. A especificidade deste sistema em relação as infecções por L. braziliensis e E. canis foi de 80,0%, e de 60,0% quanto a infecção por B. canis. A especificidade relacionada à vacinação por Leishmune® e pela Leish-Tec® foi de 90,0%, e na LBSap foi de 50,0%. A combinação dos sistemas A4−rLci1A e E4−rLci2B para o ensaio sorológico único, LeishPlex, apresentou sensibilidade de 85,0% nos cães assintomáticos, e 100,0% nos grupos oligossintomático e sintomático. A especificidade em cães infectados por L. braziliensis foi de 100,0%, enquanto que em E. canis foi de 70,0%, e em B. canis foi 60,0%. Nos cães vacinados pela Leishmune®, Leish-Tec® e LBSap observou-se 100,0% de especificidade. Portanto, a inovação LeishPlex resultou em uma elevação da precisão geral de acertos. O conjunto de dados evidenciados no presente trabalho fortalecem a sorologia por CF como uma importante abordagem para o diagnóstico sorológico da LVC.
metadata.dc.description.abstracten: Serologic tests for Leishmania are key to determine the euthanasia of infected dogs as a control measure of Visceral Leishmaniasis in Brazil. In the present study, we sought to evaluate the performance of serologic methods that are currently – and those that have already been – adopted by the Ministry of Health of Brazil (DPP, ELISA and IFAT), as well as the serology by Flow Cytometry (FC), in the diagnosis of Canine Visceral Leishmaniasis (CVL). The tests were conducted in a wide variety of serum samples, that included dogs naturally infected with Leishmania infantum with different clinical forms, dogs infected with other canine protozoosis (L. braziliensis, Trypanosoma cruzi, Ehrlichia canis and Babesia canis), and vaccinated against CVL (Leishmune®, Leish-Tec® and LBSap). Regarding the official tests, the main finding was associated to the high specificity of the DPP (99.4%) in relation to ELISA (89.9%) and IFAT (75.2%). For the LeishFlow test, it was worth noting a sensitivity of 95.0% in all asymptomatic, oligosymptomatic and symptomatic dogs. The specificity of LeishFlow in serum samples of dogs infected with L. braziliensis was 80.0%, 55.6% in T. cruzi, 93.3% in E. canis, and 100.0% in B. canis. In the dogs vaccinated with Leishmune®, Leish-Tec® and LBSap, 100.0% of specificity was observed. The next step of the work sought the development of an innovative approach in FC serology by coupling recombinant antigens to polystyrene beads. The multiepitope antigens PQ20 e C1, and the recombinants rLci1A e rLci2B were coupled to different beads generating the antigenic systems C6–PQ20, E7–C1, A4–rLci1A and E4–rLci2B. It was observed that the systems A4–rLci1A and E4–rLci2B were the only ones that were properly functional to the research of IgG canine antibodies. The serological assay by the system A4–rLci1A presented sensitivity of 85,0% in the asymptomatic dogs, and 95,0% in the oligosymptomatic and symptomatic ones. The specificity of this system in dogs infected by L. braziliensis was 100,0%, whereas in E. canis and B. canis infections this value was 30,0% and 20,0% respectively. In dogs vaccinated with Leishmune® and Leish-Tec® the specificity was 70,0%, e with LBSap it was 80,0%. The antigenic system E4–rLci2B, in turn, showed sensitivity of 85,0% in asymptomatic animals, and of 100,0% in oligosymptomatic and symptomatic dogs. The specificity of this system concerning infections by L. braziliensis and E. canis was 80,0%, and 60,0% concerning the infection by B. canis. The specificity regarding the vaccination with Leishmune® and Leish-Tec® was 90,0%, and with LBSap it was 50,0%. The combination of the systems A4−rLci1A and E4−rLci2B for a single serological assay, LeishPlex, presented sensitivity of 85,0% in asymptomatic animals, and of 100,0% in oligosymptomatic and symptomatic dogs. The specificity in dogs infected by L. braziliensis was 100,0%, while in E. canis it was 70,0%, and 60,0% concerning the infection by B. canis. In the dogs vaccinated with Leishmune®, Leish-Tec® and LBSap, 100.0% of specificity was observed. Thus, the innovative LeishPlex yielded increased accuracy. The data set evidenced by the present work strengthened the FC serology as an important approach for CVL serological diagnosis.
Description: Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas. CIPHARMA, Escola de Farmácia, Universidade Federal de Ouro Preto.
URI: http://www.repositorio.ufop.br/handle/123456789/7907
metadata.dc.rights.license: Autorização concedida ao Repositório Institucional da UFOP pelo autor, 09/06/2016, com as seguintes condições: disponível sob Licença Creative Commons 4.0, que permite copiar, distribuir e transmitir o trabalho, desde que seja citado o autor e licenciante. Permite a adaptação desta desde que outros compartilhem pela mesma licença.
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