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Title: Ensaio pré-clínico vacinal em hamsters para análise da imunogenicidade de uma nanoformulação contra a leishmaniose visceral.
Authors: Cabrera González, Marco Antonio
metadata.dc.contributor.advisor: Giunchetti, Rodolfo Cordeiro
Mosqueira, Vanessa Carla Furtado
Keywords: Vacinas
Nanotecnologia
Hamster como animal de laboratorio
Issue Date: 2016
metadata.dc.contributor.referee: Mosqueira, Vanessa Carla Furtado
Rezende, Simone Aparecida
Araújo, Ricardo Nascimento
Citation: CABRERA GONZÁLEZ, Marco Antonio. Ensaio pré-clínico vacinal em hamsters para análise da imunogenicidade de uma nanoformulação contra a leishmaniose visceral. 2016. 79 f. Dissertação (Mestrado em Biotecnologia) – Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Universidade Federal de Ouro Preto, Ouro Preto, 2016.
Abstract: A leishmaniose visceral é causada pelo parasito Leishmania chagasi (sinonímia L. infantum) e tem como medidas de controle preconizada pelo Ministério da Saúde/Brasil a eutanásia do cão doente, principal reservatório do parasito. Diante do impacto social que este procedimento causa perante a sociedade, o desenvolvimento de uma vacina anti-LVC faz-se necessário e torna uma importante medida de controle da transmissão do parasito ao homem. Deste modo, o objetivo deste estudo foi avaliar o potencial de partículas submicrômicas do polímero ácido poli-D,L-láctico (PLA) e quitosana de baixo peso molecular, como carreadoras de antígenos vacinais contra leishmaniose visceral em modelo hamster. Neste contexto, foi realizado um ensaio pré-clínico vacinal com diferentes grupos experimentais, entre os quais: (i) Controle (solução salina estéril a 0,85%); (ii) Saponina (SAP; 100 μg/dose); (iii) Partícula Submicrométrica Pequena vazia (PSmP); (iv) Partícula Submicrométrica Grande vazia (PSmG); (v) Antígeno bruto de Leishmania amazonensis (LA); (v) Antígeno bruto L. amazonensis associado ao adjuvante saponina (LASAP); (vi) Partícula Submicrométrica Pequena contendo antígeno bruto de L. amazonensis (LAPSmP); e (vii) Partícula Submicrométrica Grande contendo antígeno bruto de L. amazonensis (LAPSmG). Dessa maneira, hamsters (Mesocricetus auratus) machos foram inoculados com três doses, por via subcutânea, em intervalo de 21 dias. O desafio experimental foi realizado com 107 promastigotas em fase estacionária de L. chagasi (cepa C46), após 30 dias da última dose. Nos tempos T0 (Antes da 1º dose), T3 (30 dias após o terceiro inóculo) e T180 (180 dias após desafio experimental com L. chagasi, e imediatamente antes da eutanásia), foram feitas coletas de sangue dos animais por punção cardíaca, para realização de teste de função hepática e renal, hemograma e análise dos níveis de IgG anti-Leishmania. Após a eutanásia dos animais, foram coletados baço e fígado para análise da carga parasitária pela técnica de diluição limitante. Os dados obtidos no presente trabalho mostraram que o emprego do polímero poli-D,L-láctico (PLA) de quitosana formulado em partículas submicrométricas associado ao antígeno bruto de L. amazonensis (formulações LAPSmP e LAPSmG) foram inócuos e seguros para administração em hamsters, além de serem imunogênicos e reduzirem drasticamente o parasitismo tecidual. Esta afirmação é baseada nos seguintes achados: (i) alterações locais e clínicas compatíveis com a manutenção dos animais; (ii) testes de função hepática e renal sem alterações; (iii) ausência de anemia e hemólise induzida durante o protocolo vacinal; (iv) indução de linfocitose após o término do protocolo vacinal, particularmente relacionada a formulação LAPSmG; (v) antigenicidade relacionada a produção de IgG total anti-Leishmania após o término do protocolo vacinal; (vi) redução do tamanho do baço, após o desafio experimental por L. chagasi, particularmente relacionada a formulação LAPSmG; (vii) redução da carga parasitária superior a 97% no baço e no fígado. Estes resultados indicam que o encapsulamento de antígeno bruto de Leishmania é uma estratégia que favorece o estabelecimento de imunogenicidade e a obtenção de elevados níveis de proteção contra a LV.
metadata.dc.description.abstracten: Visceral leishmaniasis is caused by the parasite Leishmania chagasi (synonymous with L. infantum) and the euthanasia of the infected dog is the recommended method for preventing the spread of the disease according to the Brazilian Ministry of Health. Due to the social impacts that euthanasia has in society, the development of an anti-canine visceral leishmaniasis (CVL) vaccine becomes a necessary means of controlling the transmission of the parasite to humans. As such, the aim of this study was to evaluate the antigen-carrying potential of submicrometric particles composed of poly-D,L lactic acid (PLA) and chitosan with a low molecular weight, utilizing hamsters as the experimental model. In this context, we performed a preclinical study of potential vaccines applied in different experimental groups: (i) Control group (sterile saline solution at 0,85%); (ii) saponin (SAP; 100 μg/dose); (iii) small, empty submicrometric particles (PSmP); (iv) large, empty submicrometric particles (PSmG); (v) crude L. amazonensis antigen associated with saponin adjuvant (LASAP); (vi) small submicrometric particles containing crude L. amazonensis antigen (LAPSmP) and (vii) large submicrometric particles containing the crude L. amazonensis antigen (LAPSmG). Male hamsters (Mesocricetus auratus) were inoculated with three subcutaneous doses of the vaccines in intervals of 21 days. The experimental injections were performed with 107 L. chagasi promastigotes (C46 strain) in stationary phase, 30 days following the first dose of the vaccine. In the time points T0 (prior to the first dose of the vaccine), T3 (21 days following the third inoculation of the promastigotes) and T180 (180 days following the experimental injection and right before euthanasia), blood samples were collected from the animals straight from within the heart. The blood samples were used for performing tests on renal and hepatic function, hemograms and for analyzing the levels of anti-Leishmania IgG. After animals euthanasia, spleen and liver samples were collected for analyzing the parasitic load through the limiting dilution technique. The data showed that the utilization of the poly-D,L lactic acid polymer (PLA) and chitosan formulated into submicrometric particles associated with the crude antigen of L. amazonensis (LAPSmP and LAPSmG formulations) were innocuous and safe for administration in hamsters in addition to being immunogenic and drastically reducing the parasite load. This results is based on the following statements: (i) local and clinical alterations compatible with the maintenance of the animals; (ii) tests showing unaltered hepatic and renal function; (iii) the lack of anemia and hemolysis induced during the vaccination protocol; (iv) lymphocyte induction following the end of the vaccination protocol; (v) antigenicity related to the total anti-Leishmania IgG; (vi) reduction in spleen size, particularly associated with the LAPSmG formulation; and (vii) a reduction of more than 97% of the parasitic load in the liver and spleen. These findings indicate that the encapsulated Leishmania crude antigens were able to stablish a prominent immunogenicity inducing a high protection levels against visceral leishmaniasis.
URI: http://www.repositorio.ufop.br/handle/123456789/7552
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