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Title: Identificação de novos antígenos candidatos vacinais contra leishmaniose visceral canina no genoma de L. infantum utilizando a bioinformática como ferramenta.
Authors: Brito, Rory Cristiane Fortes de
metadata.dc.contributor.advisor: Reis, Alexandre Barbosa
Resende, Daniela de Melo
Keywords: Bioinformática
Leishmaniose visceral
Clonagem
Pichia stipitis
Issue Date: 2014
metadata.dc.contributor.referee: Reis, Cristina Helena dos Santos
Marinho, Flávia Dias Marques
Souza, Jacqueline de
Citation: BRITO, Rory Cristiane Fortes de. Identificação de novos antígenos candidatos vacinais contra leishmaniose visceral canina no genoma de L. infantum utilizando a bioinformática como ferramenta. 2014. 111f. Dissertação (Mestrado em Ciências Farmacêuticas) – Escola de Farmácia, Universidade Federal de Ouro Preto, Ouro Preto, 2014.
Abstract: A leishmaniose visceral canina (LVC) é uma zoonose na América Latina, e o cão possui um papel central como reservatório do parasito e na transmissão da infecção para o vetor no ciclo urbano da Leishmania infantum. A vacinologia reversa permite realizar a predição de epítopos in silico de células B e T, que são importantes na resposta imune, permitindo o desenho de vacinas com tempo reduzido. O objetivo deste trabalho foi selecionar genes do protozoário L. infantum candidatos à vacina contra LVC. Esse objetivo foi divido em duas etapas, sendo a primeira a seleção de antígenos utilizando ferramentas de bioinformática e a segunda a clonagem e expressão dos antígenos selecionados em um sistema eucarioto. Na ETAPA I foi realizado o download do proteoma predito da espécie L. infantum, com 8.241 proteínas, que foi usado em todas as análises subsequentes. As predições foram feitas utilizando-se os seguintes algoritmos: a) para MHC-I, NetCTL e NetMHC; b) para MHC-II, NetMHCII; c) para células B, BepiPred, AAP12 e BCPred12 enquanto que para a predição da localização subcelular das proteínas foram utilizados Sigcleave, TargetP e WoLF PSORT. Foram analisados 12 alelos MHC-I humanos e sete alelos MHC-I de camundongos, e no contexto de MHC-II, foram analisados 14 alelos humanos e três de camundongos. Após a realização das predições, foi necessário o desenvolvimento de um Banco de Dados relacional em um Sistema Gerenciador de Banco de Dados (SGBD), o MySQL, para a integração dos resultados e pré-seleção das proteínas baseado nos seguintes critérios: proteínas secretadas/excretadas ou de membrana plasmática, com epítopos preditos com afinidade pelos 19 alelos de MHC-I utilizados e epítopos preditos com afinidade por no mínimo 14 alelos de MHC-II, além de epítopos preditos para células B. Em seguida, foi feita uma busca por similaridade de sequências com os proteomas preditos de humano, de cão e de camundongo a fim de evitar reações autoimunes no ato da vacinação, para isso foi utilizado o algoritmo BLASTp, do pacote Blastall. Após o alinhamento de sequências, as proteínas com pouca similaridade foram confrontadas com a rede predita de interação proteínaproteína do parasito, desenvolvida pelo grupo de pesquisa. Na ETAPA II, as proteínas selecionadas foram clonadas no vetor de clonagem pGEM T easy, seguido da clonagem no vetor de expressão pPICZα-A, onde os clones foram confirmados pela PCR e digestão enzimática. Após essa etapa, os plasmídeos pPICZα-A recombinantes foram linearizados e transformados na levedura Pichia pastoris, integrando-se no gemona da levedura. Os clones recombinantes foram selecionados por PCR. Através das ferramentas de bioinformática, foram selecionadas quatro proteínas candidatas a uma vacina contra LVC. Neste trabalho foi mostrado o resultado de clonagem e expressão de dois genes que codificam duas proteínas.
metadata.dc.description.abstracten: Canine visceral leishmaniasis (CVL) is a zoonose in Latin America, and dogs have a central role as reservoirs of the parasite and in the transmission of the infection to the vector in the urban cycle of Leishmania infantum. Reverse vaccinology allows making epitope prediction for T and B cells in silico, which are important for protective immune responses, allowing the design of vaccines with reduced cost and time. Previous studies showed the feasibility of making epitope prediction in proteins of protozoa using open source algorithms. The objective of this work was to select genes from the protozoan L. infantum candidates to vaccine against CVL, and it was divided in two steps. The first step was to select antigens using bioinformatics tools and the second was to clone and express the antigens selected in an eukaryotic system. In first step, the download of the predicted proteome of L. infantum with 8,241 proteins was made. Then, it was used in all subsequent analyzes. Epitope prediction was made using the following algorithms: a) to MHC-I, NetCTL and NetMHC; b) to MHC-II, NetMHCII; c) to B cells, BepiPred, AAP12 and BCPred12, while for the prediction of subcellular localization of proteins Sigcleave, TargetP and WoLF PSORT were used. Copies of each algorithm were installed in local servers. Algorithms analyzed 12 human MHC-I alleles and seven mouse MHC-I alleles and, in the context of MHC-II, they analyzed 14 human alleles and three mouse alleles. A relational Database was developed in a Management System Database, MySQL, that was responsible for integrating results of all predictions and pre-selection of proteins based on the following criteria: secreted/excreted or plasma membrane proteins, with epitopes predicted for binding all 19 MHC-I alleles analyzed and at least 14 MHC-II alleles, and epitopes predicted for B cell. Next, it was made a search for sequence similarity with human, dog and mouse predicted proteomes using BLASTp algorithm from Blastall package, in order to prevent autoimmune reactions upon vaccination. After alignment of sequences, proteins with little similarity were confronted with the predicted protein-protein interaction network of the parasite developed in-house. In step II, the selected proteins were cloned into cloning vector pGEM T easy, followed by cloning into the expression vector pPICZα-A, and the clones were confirmed by PCR and restriction enzyme digestion. After this, the recombinant plasmids pPICZα-A were linearized and transformed into the yeast Pichia pastoris, integrating them into yeast genome. Recombinant clones were selected by PCR. Through bioinformatics tools four proteins candidates for a vaccine against CVL were selected. In this work, cloning and expression results for only two genes that encode two proteins were showed.
Description: Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas. CIPHARMA, Escola de Farmácia, Universidade Federal de Ouro Preto.
URI: http://www.repositorio.ufop.br/handle/123456789/7315
metadata.dc.rights.license: Autorização concedida ao Repositório Institucional da UFOP pelo autor, 29/01/2015, com as seguintes condições: disponível sob Licença Creative Commons 4.0, que permite copiar, distribuir e transmitir o trabalho, desde que seja citado o autor e licenciante.
Appears in Collections:CIPHARMA - Mestrado (Dissertações)

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