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Title: Métodos de extração com partição a baixa temperatura para a determinação de marcadores biológicos de exposição ao benzeno, em urina, por UHPLC-MS/MS.
Authors: Gomes, Rafaela de Paiva
metadata.dc.contributor.advisor: Afonso, Robson José de Cássia Franco
Coutrim, Maurício Xavier
Keywords: Benzeno
Urina - análise
Espectometria de massa
Issue Date: 2016
metadata.dc.contributor.referee: Arcuri, Arline Sydneia Abel
Augusti, Rodinei
Citation: GOMES, Rafaela de Paiva. Métodos de extração com partição a baixa temperatura para a determinação de marcadores biológicos de exposição ao benzeno, em urina, por UHPLC-MS/MS. 2016. 175 f. Dissertação (Mestrado em Engenharia Ambiental) – Escola de Minas, Universidade Federal de Ouro Preto, Ouro Preto, 2016.
Abstract: A discussão sobre marcadores biológicos de exposição ao benzeno (MBE-Bz) vem evoluindo no Brasil e no mundo. O uso do ácido trans, trans-mucônico urinário (u-ttMA) como MBE-Bz está sendo questionado, uma vez que o mesmo pode sofrer interferências do ácido sórbico, da exposição simultânea ao tolueno e dos hidrocarbonetos policíclicos aromáticos. Recentemente, a literatura aponta para a utilização do ácido S-fenilmercaptúrico urinário (u-SPMA) como MBE mais adequado e específico ao benzeno. Neste trabalho foram desenvolvidos e validados dois novos métodos analíticos capazes de extrair e quantificar estes MBEs de amostras de urina (método A: determinação do u-SPMA e método B: determinação simultânea do u-ttMA e u-SPMA). Na etapa de preparo da amostra foi desenvolvido e validado o procedimento de extração com partição em baixa temperatura (LTPE). Esta técnica possui baixo custo operacional, utiliza pequenas quantidades de amostra e solvente, é eficiente para extração de compostos polares e apolares em diversas matrizes aquosas, além de possuir um número de etapas reduzido, o que a torna de simples operação e aumenta a frequência analítica. Com o objetivo de avaliar o procedimento de extração e clean up da amostra, as seguintes variáveis foram estudadas sistematicamente através de planejamento fatorial completo 22 com quintuplicata no ponto central: (1) volume de solvente extrator e (2) volume de HCl 6 mol.L-1 adicionado. Para os dois métodos (análise do u-SPMA e análise simultânea do u-ttMA e do u-SPMA) as seguintes condições operacionais apresentaram os melhores rendimentos de extração dos analitos das amostras de urina: 600 μL de amostra de urina, 600 μL de acetonitrila como solvente extrator, 30 μL de HCl 6 mol.L-1 e tempo de 3 horas de congelamento a -20oC. As determinações dos compostos estudados foram realizadas pela separação por cromatografia líquida de ultra alta eficiência (UHPLC) e espectrometria de massas sequencial (MS/MS), com ionização por eletronebulização (ESI). Para a construção das curvas analíticas e correções dos efeitos de matriz no processo de ionização, uma nova forma de quantificação foi proposta e validada, usando as razões entre as áreas dos picos dos analitos nos extratos e as áreas do padrão adicionado automaticamente via injetor do UHPLC, em duas corridas cromatográficas consecutivas. O procedimento desenvolvido para extração do u-ttMA foi comparado com o método extração em fase sólida (SPE) com cartucho contendo trocador iônico forte (SAX). Os métodos usando LTPE e UHPLC/MS/MS foram validados, apresentando linearidade nas faixas de trabalho (R2 > 0,999), precisão (coeficientes de variação menor do que 7,0%), exatidão (94,1 e 112,0 %) e sensibilidade adequadas. Os limites de detecção dos métodos (MLOD) para determinação do u-SPMA e determinação simultânea do u-SPMA e u-ttMA foram de 0,02 e 0,01 μg.L-1 e os limites de quantificação dos métodos (MLOQ) foram de 0,084 e 0,035 μg.L-1, respectivamente. Para o u-ttMA, utilizando LTPE, o MLOD foi de 0,9 μg.L-1 e o MLOQ foi de 2,7 μg.L-1, valores cerca de duas vezes menores do que os encontrados para SPE-SAX. Os métodos foram aplicados em análises de 52 amostras de urina de indivíduos não expostos ocupacionalmente ao benzeno na qual foi evidenciada diferença estatística significativa entre fumantes e não fumantes com 95% de confiança. O valor de correlação entre concentrações do u-ttMA e do u-SPMA, ρ entre 0,14 a 0,28, está de acordo com os dados descritos na literatura.
metadata.dc.description.abstracten: The discussion of biological markers of exposure to benzene (BME-Bz) has been evolving in Brazil and worldwide. The use of urinary trans, trans-muconic acid (u-ttMA) as BME-Bz is being questioned, because it may suffer interference from sorbic acid, the simultaneous exposure to toluene and polycyclic aromatic hydrocarbons. Recently, the literature points to the use of urinary S-phenylmercapturic acid (u-SPMA) as BME, is more appropriate and specific to benzene. In this work, it was developed and validated two new analytical methods to extract and quantify these BMEs fron urine samples (method A: determination of u-SPMA and method B: simultaneous determination of u-ttMA and u-SPMA). For the samples preparation, it was developed and validated a low temperature partitioning extraction procedure (LTPE). This technique has a low operating cost, using small amounts of sample and solvent, it is efficient for the extraction of polar and nonpolar compounds in various aqueous matrices, in addition to having a reduced number of stages, which makes it easy to operate and increases the analytical frequency. In order to evaluate the extraction procedure and clean up the sample, the following variables were studied systematically by 22 full factorial design with five replications at the center point: (1) volume of solvent extractor and (2) volume of HCl 6 mol L-1 added. For both methods (analysis of u-SPMA and simultaneous analysis of the u-ttMA and u-SPMA) the following operating conditions showed the best extraction efficiency of analytes from urine samples: 600 μL urine sample, 600 μL of acetonitrile as solvent extractor, 30 μL of HCl 6 mol L-1 and the time of 3 hours at freezing temperate of -20 °C. The determinations of the studied compounds were obtained by ultra high efficiency liquid chromatographic separation (UHPLC) and electrospray ionization (ESI) tandem mass spectrometry (MS/MS). To design the analytical curves and correction of matrix effects in the ionization process, a new form of quantification was proposed and validated, using the ratios of the peak areas of the analytes in the extracts and theareas of an automatically added standard quantity, via UHPLC injector, in two consecutive chromatographic runs. The LTPE procedure developed for u-ttMA extraction was compared to the solid phase extraction method (SPE) with strong ion exchanger (SAX) cartridge. The methods using LTPE and UHPLC/MS/MS analyzes were validated, with linear adjustment at the working ranges (R2 > 0.999), the precision with variation coefficient lower than 7.0%, accuracy between 94.1 to 112.0 % and high sensitivity. The method detection limits (MLOD) to the u-SPMA and simultaneous determination of u-SPMA and u-ttMA was 0.01 and 0.02 μg L-1 and the method limits of quantification (MLOQ) was 0.084 and 0.035 μg L-1. For the u-ttMA using LTPE and UHPLC/MS/MS, the MLOD was 0.9 μg L-1 and MLOQ was 2.7 μg L-1 values about two times lower than those found in the validations using SPE- SAX. The methods were applied to the analysis of 52 individuals urine samples nonexposed individuals to benzene which showed statistically significant differences between smokers and nonsmokers at 95% confidence level. The correlation value between concentrations of u-ttMA and u-SPMA, ρ between 0.14 a 0.28, was consistent with the data described in the literature.
Description: Programa de Pós-Graduação em Engenharia Ambiental. Núcleo de Pesquisas e Pós-Graduação em Recursos Hídricos, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto.
URI: http://www.repositorio.ufop.br/handle/123456789/6976
metadata.dc.rights.license: Autorização concedida ao Repositório Institucional da UFOP pelo(a) autor(a) em 13/09/2016 com as seguintes condições: disponível sob Licença Creative Commons 4.0 que permite copiar, distribuir e transmitir o trabalho desde que sejam citados o autor e o licenciante. Não permite o uso para fins comerciais nem a adaptação.
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