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Title: Baccharis trimera inibe a produção de espécies reativas de oxigênio através da via de sinalização da PKC e NADPH oxidase em células SK Hep-1.
Authors: Araújo, Glaucy Rodrigues de
metadata.dc.contributor.advisor: Costa, Daniela Caldeira
Chaves, Míriam Martins
Keywords: Rutina
Estresse oxidativo
Issue Date: 2015
Citation: ARAÚJO, Glaucy Rodrigues de. Baccharis trimera inibe a produção de espécies reativas de oxigênio através da via de sinalização da PKC e NADPH oxidase em células SK Hep-1. 2015. 120f. Tese (Doutorado em Ciências Biológicas) - Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Universidade Federal de Ouro Preto, Ouro Preto, 2015.
Abstract: Baccharis trimera, popularmente conhecida como "carqueja", é uma planta nativa sul-americana que possui uma alta concentração de compostos fenólicos e, portanto, alto potencial antioxidante. Apesar do potencial antioxidante de B. trimera descrito na literatura, não existem relatos sobre as vias de sinalização envolvidas neste processo. A enzima NADPH oxidase é uma fonte importante na produção de espécies reativas de oxigênio (ERO) em condições patológicas, como no câncer, no diabetes e em processos inflamatórios. Esta enzima é ativada por meio de diferentes moduladores, entre os quais destaca-se a proteína cinase C (PKC), que fosforila a subunidade p47phox da NADPH oxidase, como um contribuinte para a ativação do complexo enzimático e a consequente geração de ERO. Com base nestas informações, o objetivo do presente estudo foi avaliar a composição fitoquímica dos extratos aquoso e hidroetanólico de Baccharis trimera bem como a influência destes extratos na modulação de ERO e na via de sinalização da PKC e NADPH oxidase em células de hepatocarcinoma humano (SK Hep-1). No presente estudo, a quercetina e a rutina foram utilizadas como controles positivos, pois o efeito antioxidante destes flavonoides tem sido bem estabelecido, sendo estes compostos já identificados em extratos de B. trimera. No extrato hidroetanólico foram identificados cinco flavonoides enquanto no extrato aquoso foram identificados três flavonoides por CLAE-EM. A atividade antioxidante in vitro por DPPH também foi avaliada e os resultados demonstraram que o extrato hidroetanólico possui um maior potencial em sequestrar o radical DPPH bem como uma maior quantidade de compostos fenólicos em comparação ao extrato aquoso. Em relação à viabilidade celular, observamos que o extrato hidroetanólico de B. trimera manteve acima de 70% a porcentagem de células viáveis, entretanto em 24 e 48 horas de incubação houve uma redução da viabilidade (<70%) em concentrações iguais ou superiores a 25μgmL-1. Em relação ao extrato aquoso observamos que a porcentagem de células viáveis foi mantida acima de 70% em 12, 24 e 48 de incubação. Em relação a produção de espécies reativas foi observado que os extratos de B. trimera (aquoso e hidroetanólico) diminuíram os níveis de ERO em células SK Hep-1 não estimuladas. Níveis reduzidos de ERO também foram observados nas células tratadas com quercetina e rutina. Os resultados mostraram que as células estimuladas com PMA / ionomicina (ativadores de PKC) tiveram um aumento significativo na produção de ERO, e esta produção voltou aos níveis basais após tratamento com o DPI (inibidor da NADPH oxidase). O extrato hidroetanólico de B. trimera e quercetina, mas não o extrato aquoso e a rutina, modularam a produção de ERO através da inibição da expressão e atividade da proteína PKC e também através da redução da fosforilação da subunidade p47phox da enzima NADPH oxidase. Em conjunto, estes resultados sugerem um mecanismo potencial de ação de B. trimera na inibição da produção de ERO através da via de sinalização da PKC/NADPH oxidase. __________________________________________________________________________________________________________________________
ABSTRACT: Baccharis trimera, popularly known as "carqueja" is a native South American plant having high concentration of phenolic compounds and therefore high potential antioxidant. Although the antioxidant potential of B. trimera described in the literature there are no reports on the signaling pathways involved in this process. The NADPH oxidase is a major source in production of reactive oxygen species (ROS) in pathological conditions such as cancer, diabetes and inflammation. This enzyme is activated by different modulators, among which we highlight protein kinase C (PKC), which phosphorylates p47phox subunit of NADPH oxidase, as a contributor to the activation of the enzyme complex and the subsequent generation of ROS . Based on this information, the aim of this study was to evaluate the phytochemical composition of aqueous and hydroethanolic extracts of Baccharis trimera and the influence of these extracts on ROS modulation induced by PKC signaling pathway in human hepatocellular carcinoma cells (SK-Hep 1). In the present study, quercetin and rutin were used as positive controls, since the antioxidant effect of these flavonoids have been well established, and these compounds have been identified in B. trimera extracts. In hydrethanolic extract five flavonoids were identified, and in the aqueous extract identified three flavonoids by CLAE-MS. The antioxidant activity in vitro was also evaluated by DPPH and the results demonstrated that the hydroethanolic extract has a higher potential scavenger the DPPH radical as well as a greater quantity of phenolic compounds as compared to aqueous extract. About cell viability, we observed that the hydroethanolic extract of B. trimera maintained above 70% of viable cells, however at 24 and 48 hours of incubation there was a reduction of viability (<70%) in concentrations equal to or greater than 25μgmL-1. About aqueous extract we found that the percentage of viable cells was maintained above 70% at 12, 24 and 48 of incubation. It was observed that extracts of B. trimera (aqueous and hydroethanolic) decreased ROS levels in the SK-Hep 1 cells unstimulated. Reduced levels of ROS were also observed in cells treated with quercetin and rutin. The results showed that cells stimulated with PMA / ionomycin (PKC activators) had a significant increase in ROS production and this production returned to basal levels after treatment with DPI (NADPH oxidase inhibitor). The B. trimera hydroethanolic extract and quercetin, but not the aqueous extract and rutin, modulate the production of ROS by inhibiting the expression and activity of PKC protein and downregulation p47phox phosphorilation. Together, these results suggest a potential mechanism of inhibition by B. trimera in ROS production by PKC/NADPH oxidase signaling pathway.
Description: Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa de Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto.
URI: http://www.repositorio.ufop.br/handle/123456789/6346
metadata.dc.rights.license: Autorização concedida ao Repositório Institucional da UFOP pelo autor, 21/03/2016, com as seguintes condições: disponível sob Licença Creative Commons 4.0, que permite copiar, distribuir e transmitir o trabalho, desde que seja citado o autor e licenciante. Não permite o uso para fins comerciais nem a adaptação desta.
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