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Title: Avaliação de uma vacina terapêutica (LBMPL) no tratamento da leishmaniose visceral utilizando o cão naturalmente infectado com Leishmania infantum como modelo experimental.
Authors: Roatt, Bruno Mendes
metadata.dc.contributor.advisor: Reis, Alexandre Barbosa
Keywords: Cão como animal de laboratório
Leishmaniose visceral
Imunoterapia
Vacinas
Issue Date: 2013
Citation: ROATT, Bruno Mendes. Avaliação de uma vacina terapêutica (LBMPL) no tratamento da leishmaniose visceral utilizando o cão naturalmente infectado com Leishmania infantum como modelo experimental. 2013. 170 f. Tese (Doutorado em Ciências Biológicas) - Universidade Federal de Ouro Preto, Ouro Preto, 2013.
Abstract: A leishmaniose visceral (LV) é uma das doenças mais negligenciadas no mundo, que afeta principalmente os países mais pobres. Epidemias urbanas de LV são observadas em várias cidades do Brasil e a doença tem sido verificada como infecção oportunista em pacientes com AIDS. Estima-se que a infecção HIV/L. infantum aumenta o risco em 100 a 2.320 vezes de se desenvolver uma LV grave. Atualmente, diversos são os relatos do surgimento de cepas resistentes do parasito aos fármacos convencionais. Sendo assim, o desenvolvimento de novas estratégias profiláticas/terapêuticas (imunofármacos) contra a doença se faz necessário e urgente. Neste contexto, muitos modelos animais experimentais já foram avaliados e o cão, se destaca como um dos melhores modelos experimentais para o estudo da LV humana (LVH) bem como seu emprego em ensaios pré-clínicos, pois apresenta características clínico-patológicas e uma história natural de doença extremamente semelhantes à LVH ativa e grave. Dessa forma, nosso estudo buscou avaliar a estratégia de tratamento empregando uma vacina terapêutica composta por antígenos totais de L. braziliensis associada ao adjuvante MPL (vacina LBMPL) para LVH empregando cães sintomáticos, naturalmente infectados por L. infantum. Assim, 16 cães infectados foram subdivididos em dois grupos experimentais: um grupo que recebeu como imunoterapia o adjuvante monofosforil lipídeo A apenas, sendo considerado grupo controle (MPL; n=6) e outro que recebeu como imunoterapia a vacina composta por antígenos de L. braziliensis associada ao adjuvante MPL (LBMPL n=10). Os animais foram submetidos a um esquema imunoterapêutico composto por 3 séries de tratamento, cada série de 10 doses com concentrações crescentes do antígeno vacinal (60μg – 300μg de antígeno protéico + 5μg - 25μg de MPL (dias 1-5) e / 300μg Ag + 25μg MPL (dias 6-10) 1ª série / 300μg Ag + 25μg MPL 2ª e 3ª séries) sob a via subcutânea com intervalo de 10 dias de descanso entre cada série. Os cães foram avaliados antes de serem tratados (T0) e após 15 (T15), 30 (T30) e 90 (T90) dias do tratamento sob os aspectos hemato-bioquímicos, imunológicos, clínicos e parasitológicos. Nossos principais resultados revelaram que a imunoterapia com a vacina LBMPL foi capaz de restabelecer e normalizar as principais alterações hematológicas (eritrócitos, hemoglobina, hematócrito e plaquetas) e bioquímicas (uréia, AST ou TGO, fosfatase alcalina, bilirrubina, e proteína total) decorrentes da LVC e presentes antes do tratamento. Além disso, cães imunotratados com a vacina LBMPL responderam na avaliação ex vivo, com aumento de linfócitos T CD3+ e suas subpopulações (T CD4+ e T CD8+), redução de linfócitos B CD21+, redução na razão T CD4+/T CD8+, aumento da razão LT/LB, aumento de células NK CD5-CD16+ e aumento de monócitos CD14+ circulantes como principais biomarcadores celulares de sucesso terapêutico no sangue periférico. Já no contexto das avaliações in vitro, animais submetidos à vacinoterapia com LBMPL desenvolveram forte memória imunológica antígeno-específica, capaz de induzir elevada atividade linfoproliferativa frente ao estímulo com antígeno solúvel de L. infantum (ASLi) acompanhado por reconhecimento preferencial de células T CD4+ e T CD8+-ASLi específicas. Interessantemente, foi também observado aumento tanto de linfócitos T CD4+IFN-+ e T CD8+IFN-+ bem como redução de linfócitos T CD4+ IL-4+ e T CD8+ IL-4+ após estimulação com ASLi e aumento na produção/secreção de citocinas pró-inflamatórias como TNF- e redução na produção de citocinas imunomodulatórias como IL-10 por células mononucleares do sangue periférico (CMSP); citocina esta, responsável pela imunopatogênese da LV grave. Estes achados caracterizam perfil de resistência a infecção por Leishmania e resposta positiva ao tratamento nos cães imunotratados com a vacina terapêutica LBMPL. De forma surpreendente, em relação aos sinais clínicos sugestivos de LVC, os animais imunotratados com LBMPL apresentaram redução drástica na intensidade e na quantidade de sinais/sintomas clínicos da LV, aumento da massa corporal além de redução da esplenomegalia avaliada clinicamente e por ultrassom, fatores estes intimamente associados ao sucesso terapêutico na doença humana. Somado-se a isso, a vacina LBMPL promoveu ainda uma redução da carga parasitária, avaliada aqui pela PCR em Tempo Real (qPCR), na medula óssea, baço e pele nos cães infectados, sendo até mesmo possível observar em alguns animais ausência de parasitismo nestes órgãos. Os resultados obtidos no presente estudo, confirmam e reafirmam a indicação do cão naturalmente infectado com L. infantum, como modelo experimental pré-clínico de altíssimo valor na leishmaniose visceral. Além disto, nossos resultados permitem também sugerir o uso da imunoterapia com a vacina terapêutica LBMPL como uma potencial proposta de tratamento na leishmaniose visceral canina e/ou humana.
metadata.dc.description.abstracten: Visceral leishmaniasis (VL) is one of the most neglected diseases in the world, affecting mostly the poorest countries. Urban epidemics of VL are observed in several cities in Brazil and the disease has been seen as an opportunistic infection in HIV patients. It is estimated that, HIV/L. infantum co-infection increases the risk by 100-2320 times to develop a severe VL. Currently, several studies have addressed the rise of resistant strains of the parasite to conventional drugs. Thus the development of new prophylactic/therapeutic (immunological agents) strategies against the disease is necessary and urgent. In this context, many animal models have been evaluated, and the dog stands as one of the best experimental models for the study of human VL (HVL) as well as in preclinical trials, since dogs present clinical and pathological characteristics and natural history of the disease extremely similar to the active and severe HVL. Thus, our study aimed to evaluate the treatment strategy employing a therapeutic vaccine composed by antigens of L. braziliensis associated with MPL adjuvant (LBMPL vaccine) for HVL using symptomatic dogs naturally infected by L. infantum. Thus, 16 infected dogs were divided into two experimental groups: a group that received immunotherapy only with monophosphoryl lipid A adjuvant, considered the control group (MPL, n=6) and another group that received immunotherapy using the vaccine composed by antigens of L. braziliensis associated with MPL as adjuvant (LBMPL, n=10). The animals were subjected to an immunotherapeutic scheme consisting of 3 treatment series, each series composed of 10 doses with increasing concentrations of the vaccine antigen (60μg - 300μg antigen protein + 5μg - 25μg of MPL (day 1-5) and 300μg of LB antigen + 25μg of MPL (day 6-10) 1st series / 300μg antigen protein + 25μg of MPL 2nd and 3rd series) by subcutaneous route and a 10-day interval between each series. The dogs were evaluated before treatment (T0) and 15 (T15), 30 (T30) and 90 (T90) days after treatment under the hematological, biochemical, immunological, clinical and parasitological aspects. Our major results showed that immunotherapy with LBMPL vaccine was able to restore and normalize main hematological (erythrocytes, hemoglobin, hematocrit and platelets) and biochemical (urea, AST or SGOT, alkaline phosphatase , bilirubin , and total protein ) parameters resulting from CVL present before treatment. In addition, in ex vivo analysis, immunotreated dogs with LBMPL vaccine responded with increased CD3+ T lymphocytes and their subpopulations (T CD4+ and T CD8+), reduction of CD21+ B lymphocytes and in the T CD4+/T CD8+ ratio, increased TL/BL ratio, NK cells (CD5-CD16+) and CD14+ monocytes as the main cellular biomarkers of therapeutic success in peripheral blood. In the in vitro context, animals subjected to LBMPL vaccinetherapy developed a strong antigen-specific immunologic memory, able to induce a high lymphoproliferative activity against L. infantum soluble antigen (ASLi) followed by a preferential recognition of ASLi-specific T CD4+ and T CD8+. Interestingly, an increase in both T CD4+IFN-+ and T CD8+IFN-+ lymphocytes was also observed as well as reduction of T CD4+IL-4+ and T CD8+IL-4+ lymphocytes after ASLi stimulation and increased production/secretion of pro inflammatory cytokines such as TNF- and reduced production of immunomodulatory cytokines such as IL-10 by peripheral blood mononuclear cells (PBMC). This cytokine (IL-10) is responsible for the severe VL immunopathogenesis. These findings characterize a resistante profile to Leishmania infection and positive response in dogs immunotreated with LBMPL therapeutic vaccine. Interestingly, concerning clinical signs of CVL, animals submitted to LBMPL vaccinetherapy showed drastic reduction in the intensity and number of clinical signs/symptoms of VL, increased body mass as well as reduction of splenomegaly assessed clinically and by ultrasound, factors closely associated with success in the treatment of human disease. In addition, the LBMPL vaccine also promoted a reduction in parasite burden, assessed by Real Time PCR (qPCR) in bone marrow, spleen and skin of infected dogs, being even possible to observe some animals with no parasitism in these organs. The results obtained in this study confirm and reaffirm the statement that naturally infected dogs with L. infantum are the most important experimental preclinical model in visceral leishmaniasis. Furthermore, our results also allow recommending the use of immunotherapy with the LBMPL therapeutic vaccine proposed as a potential treatment for visceral leishmaniasis in both the canine and human disease.
Description: Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto.
URI: http://www.repositorio.ufop.br/handle/123456789/4401
metadata.dc.rights.license: Autorização concedida ao Repositório Institucional da UFOP pelo autor(a), 06/12/2013, com as seguintes condições: disponível sob Licença Creative Commons 3.0, que permite copiar, distribuir e transmitir o trabalho, desde que seja citado o autor e licenciante. Não permite o uso para fins comerciais nem a adaptação desta.
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