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Title: Imunogenicidade da vacina LBSapSal e investigação parasitológica/molecular em cães após desafio intradérmico com leishmania (Leishmania) chagasi e extrato de glândula salivar de Lutzomyia longipalpis.
Authors: Soares, Rodrigo Dian de Oliveira Aguiar
metadata.dc.contributor.advisor: Reis, Alexandre Barbosa
Keywords: Leishmaniose visceral
Vacinas
Cão
Issue Date: 2010
Citation: SOARES, R. D. de O. A. Imunogenicidade da vacina LBSapSal e investigação parasitológica/molecular em cães após desafio intradérmico com leishmania (Leishmania) chagasi e extrato de glândula salivar de Lutzomyia longipalpis. 2010. 123 f. Dissertação (Mestrado em Ciências Biológicas) - Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Universidade Federal de Ouro Preto, Ouro Preto, 2010.
Abstract: Leishmaniose visceral humana (LVH) e leishmaniose visceral canina (LVC) são as mais importantes doenças emergentes causadas por Leishmania (L.) chagasi com elevada prevalência nos países latino-americanos, principalmente no Brasil. Durante um século de investigação, depois da descoberta do agente etiológico da leishmaniose, poucos avanços têm ocorrido na pesquisa do tratamento e até mesmo de vacinas e as medidas de controle têm sido decepcionantes. O desenvolvimento de uma vacina protetora contra a LVC é uma abordagem alternativa para interromper o ciclo da LV doméstica. Considerando a importância das proteínas salivares de flebotomíneos sendo potentes imunógenos, obrigatoriamente co-depositados com o parasito de Leishmania durante a transmissão, a sua inclusão em uma vacina anti-Leishmania iria explorar a imunidade anti-saliva após uma picada de flebotomíneo infectado e preparar uma resposta imune protetora anti-Leishmania. Assim, neste trabalho foi investigada a imunogenicidade e efeito protetor da vacina LBSapSal em cães após o desafio. Vinte cães foram classificados em quatro grupos: i) controle (n = 5) receberam 1 mL de solução salina estéril 0,9%; ii) grupo Sal (n = 5) receberam extrato de glândula salivar (SGE), elaborado a partir de 5 ácinos das glândulas salivares de Lutzomyia longipalpis em 1 ml de solução salina estéril 0,9%; iii) Grupo LBSal (n = 5) receberam 600 μg de proteína de promastigotas de L. braziliensis mais SGE em 1 mL de solução salina estéril 0,9%, (iv) o grupo LBSapSal (n = 5 ) recebeu 600 μg de proteína de promastigotas de L. braziliensis e 1 mg de saponina em conjunto com a SGE em 1 mL de solução salina estéril 0,9%. O protocolo de imunização constou de três injeções subcutâneas em intervalos de 4 semanas. Posteriormente, os cães foram inoculados por via intradérmica com 1 × 107 promastigotas em fase estacionária de L. (L.) chagasi na presença de glândula salivar de L. longipalpis e acompanhado por um período de 435 dias após o desafio (435dpd). Análise da resposta imune humoral mostrou que antes e durante o acompanhamento longitudinal após o desafio, o grupo LBSapSal mostrou aumento dos níveis de IgG total, IgG1 e IgG2, sugerindo uma possível resposta imune mista (tipo I e II) após a vacinação. A investigação da resposta imune celular com base no perfil imunofenotípico de células mononucleares do sangue periférico (PBMC) mostrou um aumento no número absoluto de linfócitos T CD5+ circulantes, refletida pela maior contagem de linfócitos T CD4+ e T CD8+, em 435dpc. Interessantemente, a vacina induziu um aumento de linfócitos T CD8+ circulantes durante todo o período após o desafio, possivelmente indicando o estabelecimento de imunidade protetora contra a infecção por Leishmania como tem sido sugerido previamente para a LVC. Consistente com essa hipótese, o grupo LBSapSal apresentou aumento da atividade linfoproliferativa in vitro sobre a estímulação antigênica com SLcA (antígeno solúvel L. chagasi) em 90 e 435 dpc, bem como aumento da freqüência (índice de estimulação) de linfócitos T CD5+ e CD8+ SLcA-específico em 435dpc. Estes resultados suportam a hipótese de que a indução de células T CD8+ podem desempenhar um papel de proteção no mecanismo de controle do parasitismo por Leishmania após a vacinação com LBSapSal, associado com a resposta imune antígeno-específica para antígenos do agente etiológico da LVC. A avaliação clínica sobre sinais sugestivos de LVC mostrou que todos os animais permaneceram assintomáticos durante todo o acompanhamento. O estudo da proteção realizado pela análise de amostras do aspirado de medula óssea através de abordagens parasitológicas (cultura em meio NNN / LIT e inquérito microscópico) e moleculares (PCR) de todos os grupos não revelou a presença de parasitas. Estes resultados mostraram que a via intradérmica de infecção experimental tem um curso longo para iniciar as manifestações clínicas e, assim, a detecção do parasita, e por isso necessitam de um período maior de acompanhamento, que poderão fornecer informações importantes que conduzirão a uma melhor compreensão sobre a imunogenicidade da vacina e sua eficácia.
metadata.dc.description.abstracten: Human visceral leishmaniasis and canine visceral leishmaniasis (CVL) are the most important emerging diseases caused by Leishmania (L.) chagasi with high prevalence in Latin American countries mainly in Brazil. During a century of research after the discovery of the etiologic agent of leishmaniasis few advances have occurred in research on treatment and even vaccines and measures control have been disappointing. The development of a protective vaccine against CVL is an alternative approach for interrupting the VL domestic cycle. Considering the importance of sand fly salivary proteins are potent immunogens obligatorily co-deposited with Leishmania parasites during transmission, their inclusion in an anti-Leishmania vaccine would exploit anti-saliva immunity following an infective sand fly bite and set the stage for a protective anti-Leishmania immune response. Thus, in this work it was investigated the immunogenicity and protective effect of LBSapSal vaccination in dogs after challenge. Twenty mongrel dogs were categorized into four groups: i) control (n = 5) received 1 mL of sterile saline 0.9%; ii) Sal group (n = 5) received sand fly gland extract (SGE) prepared from 5 acini of salivary glands of Lutzomyia longipalpis in 1 mL of sterile saline 0.9%; iii) LBSal group (n = 5) received 600 μg of L. braziliensis promastigote protein plus SGE in 1 mL sterile 0.9% saline; (iv) the LBSapSal group (n = 5) received 600 μg of L. braziliensis promastigote protein plus 1 mg of saponin together with SGE in 1 mL sterile 0.9% saline. The immunization protocol consisted of three subcutaneous injections at intervals of 4 weeks. Afterwards, the dogs were intradermally infected with 1×107 late-log-phase promastigotes of L. (L.) chagasi in the presence of sand fly saliva of L. longipalpis and accompanied by a follow-up of 435 days post challenge (435dpc). Analysis of the humoral immune response showed that before and during the longitudinal follow-up after the challenge, the LBSapSal group showed increased levels of total IgG, IgG1 and IgG2, suggesting a possible mixed immune response (type I and II) after vaccination. The investigation of the cellular immune response based on the immunophenotypic profile of peripheral blood mononuclear cells (PBMC) showed an augment absolute number of circulating CD5+ T lymphocytes, reflected by higher counts of T CD4+ and T CD8+ lymphocytes, in 435dpc. Interestingly, the vaccine induced an increase circulating T CD8+ lymphocytes throughout the period after challenge, possibly indicating the establishment of protective immunity against Leishmania infection as has been suggested previously for CVL. Consistent with this hypothesis, the LBSapSal group exhibited increased lymphoproliferative activity upon in vitro antigenic stimuli with SLcA (soluble L. chagasi antigen) in 90 and 435 dpc as well as increased frequency (stimulation index) of SLcA-specific CD5+ and CD8+ T-lymphocytes in 435dpc. These results support the hypothesis that induction of CD8+ T-cells may play a protective role in the mechanism of control of parasitism by Leishmania after LBSapSal treatment associated with the antigen-specific immune response to antigens from the etiological agent of CVL. The clinical evaluation regarding suggestive signs of CVL showed that all animals remained asymptomatic during the all follow-up. The protection study performed by analysis in aspirates of bone marrow samples through parasitological (culture in NNN/LIT medium and microscopical investigation) and molecular approaches (PCR) of all groups did not reveal the presence of parasites. These results showed that the intradermal route of experimental infection has a long course to start the clinical manifestations and therefore the detection of the parasite, and so needing a longer period of follow-up, that may provide important information that will lead to a better understanding on vaccine immunogenicity and efficacy.
Description: Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto.
URI: http://www.repositorio.ufop.br/handle/123456789/3939
metadata.dc.rights.license: Autorização concedida ao Repositório Institucional da UFOP pelo autor, 23/10/2014, com as seguintes condições: disponível sob Licença Creative Commons 3.0, que permite copiar, distribuir e transmitir o trabalho, desde que seja citado o autor e licenciante. Não permite o uso para fins comerciais nem a adaptação desta.
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