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Title: História natural da leishmaniose visceral em hamster “Mesocricetus auratus” experimentalmente infectados por duas cepas de Leishmania infantum com perfis distintos de virulência e patogenicidade.
Authors: Moreira, Nádia das Dores
metadata.dc.contributor.advisor: Reis, Alexandre Barbosa
Keywords: Leishmaniose visceral
Leishmania - estudos experimentais
Hamster como animal de laboratório
Baço
Fígado
Issue Date: 2012
Citation: MOREIRA, N. das D. História natural da leishmaniose visceral em hamster “Mesocricetus auratus” experimentalmente infectados por duas cepas de Leishmania infantum com perfis distintos de virulência e patogenicidade. 2012. 145 f. Dissertação (Mestrado em Ciências Biológicas) - Universidade Federal de Ouro Preto, Ouro Preto, 2012.
Abstract: A leishmaniose visceral humana (LVH) é a mais temida e devastadora dentre as várias formas clínicas das leishmanioses. Esta doença negligenciada, tem ganhando grande importância devido as altas taxas de mortalidade. A espécie do parasito, imunidade, características genéticas e estado nutricional do hospedeiro desempenham papel crucial no desenvolvimento espectral das formas clínicas, podendo evoluir de uma infecção assintomática inaparente para uma forma clínica letal, em casos extremos. O tratamento quimioterápico, não é suficiente para controlar e deter a LVH em todo mundo. Um agravante importante, é a ausência de uma vacina que possa ser empregada em programas de controle da LV. Portanto, o desenvolvimento de novas estratégias profiláticas e terapêuticas contra a LV se faz necessário e urgente. Muitos modelos animais experimentais, como roedores e primatas não humanos ja foram avaliados, cada um apresentando características específicas, sendo que nenhum destes, reproduz com precisão o que acontece na LV humana e canina. Neste contexto, no presente estudo, o modelo hamster (Mesocricetus auratus) foi usado, e os animais foram divididos em dois grandes grupos experimentais: um grupo infectado com a cepa padrão da OMS (MHOM/BR/74/PP75; n=120) e outro infectado com a cepa selvagem (n=120) de L. infantum, além de um grupo controle não infectado (C; n=80). Estes dois grandes grupos foram subdivididos em três subgrupos referentes às vias de inóculo utilizada: intradérmica (ID), intracardíaca (IC) e intraperitoneal (IP). Os animais foram avaliados durante nove meses após a infecção para a análise da sobrevida. Para cada tempo, dez animais/grupo foram avaliados. Amostras de sangue, soro, fragmentos de fígado e baço foram colhidos para realização de diferentes análises laboratoriais. As características clinicopatológicas, hematológicas, o perfil bioquímico da função renal e hepática além do quadro histopatológico foram alvos deste trabalho. Além disso, foram utilizadas abordagens moleculares empregando a PCR em tempo real quantitativa (qPCR e qRT-PCR) para determinar a carga parasitária no fígado e baço, bem como, para avaliar a expressão de citocinas no baço, respectivamente. Nossos principais resultados revelaram o aparecimento de sinais clínicos e a presença de biomarcadores laboratoriais típicos em ambas as cepas empregadas. No entanto, de um modo em geral, a cepa selvagem foi capaz de induzir doença grave, com evolução fatal principalmente nos hamsters inoculados pela via IC. As principais alterações hematológicas encontradas em hamsters que evoluíram para infecção ativa da LV foram: anemia, leucopenia acompanhada de neutropenia, linfopenia, e em alguns casos monocitopenia e eosinopenia. Os parâmetros bioquímicos relacionados à avaliação da função renal mostraram elevação de uréia e creatinina em ambas às cepas utilizadas. Já em relação à função hepática observou-se elevação nos níveis de ALT e AST nos diferentes grupos e tempos avaliados. No compartimento hepático, observou-se a instalação de processo inflamatório nos espaços-porta com a evolução da infecção, acompanhada pela formação de granulomas, com maior frequência e intensidade no grupo IC. A hipoplasia dos folículos linfóides, associada à proliferação de macrófagos da polpa vermelha, destruição da arquitetura esplênica foram mais evidentes no grupo IC, por apresentar maior gravidade da doença. A qPCR mostrou-se sensível na detecção do DNA de L. infantum tanto no fígado como no baço, em todos os grupos experimentais independente da cepa utilizada e do período de avaliação. Como observado na análise do índice de LDU o qPCR também evidenciou maior parasitismo no fígado e baço principalmente nos animais infectados com a cepa selvagem, pela via IC. Além disso, foi verificado forte correlação entre parasitismo tecidual e produção de anticopos anti-IgG. A predominância da expressão de mRNA para IFN-, nos animais infectados com a cepa PP75 no fim do período de avaliação no grupo IC, sugere maior expressão desta citocina em resposta à replicação parasitária, induzindo um perfil inflamatório concomitante e intenso. A resposta imune observada em hamsters infectados com a cepa selvagem pela via IC durante o período inicial (3 meses) foi relacionada com a expressão aumentada de IL-10 e TGF-. Este fenômeno parece suprimir estes animais permitindo o estabelecimento da infecção ativa bem como a proliferação do parasito no baço. Neste sentido, a inoculação por via IC é rapidamente seguida pela proliferação de parasitos, exibindo sinais clínicos típicos da LV semelhantes aos observados em seres humanos e/ou cães naturalmente infectados. Os resultados obtidos no presente estudo, sugerem o uso de hamsters como modelo experimental para avaliar os aspectos imunopatológicos durante o curso da LV ativa. Além disto, considerando que os hamsters experimentalmente infectados apresentaram muitas das características clínicas e imunopatológicas como observado na LVH e LVC, este modelo experimental é altamente relevante em avaliações pré-clínicas de potenciais drogas leishmanicidas e vacinas.
metadata.dc.description.abstracten: Human Visceral Leishmaniasis (HVL) is the most dreaded and devastating parasitic disease amongst the various forms of leishmaniasis. This neglected disease, has gained immense importance because of its high mortality rate. The parasite acts on the hosts immune status and plays a crucial role in the manifestation of a spectrum of clinical syndromes, which can, in most extreme cases, go from an asymptomatic infection to a fatal form of HVL. Chemotherapy alone is not sufficient to control and contain VL spreading around of the world. The lack of vaccines to prevent and/or treat this infection, as well as the emergence of drug resistant parasites, is a serious impediment to controlling VL. Therefore, developing new prophylactic and therapeutic strategies against VL is urgently required. Many experimental animal models like rodents and monkeys have been developed, each with specific features, but none accurately reproduce what happens in humans and canine VL. The prerequisite of a reliable animal model is that it should have a considerably good correlation with the clinical situation. Moreover, it also should mimic the pathological features and immunological responses observed in humans and dogs when exposed to a strain variety of L. infantum with different virulent and pathogenicity characteristics. In this respect, herein we use hamsters (Mesocricetus auratus) subdivided into two major experimental groups according to the strain applied: 120 animals were infected with the reference L. infantum strain (WHO/MHOM/BR/74/PP75) and 120 animals were infected with the wild strain. For each strain, three different routes of inoculation were used: intradermal (ID, n=40), intraperitoneal (IP, n=40) and intracardiac (IC, n=40). Animals not infected were used as a control group (C, n=80). The animals were followed for a nine month post-infection evaluation for survival analysis. For each time point of the follow-up, ten animals per group were evaluated. Samples of blood, serum, liver and spleen were collected for the different laboratorial analysis. Clinicalpathological, hematological, the seric biochemical profile (renal and hepatic) and histopathological picture were also evaluated. In addiction we quantified the parasite burden in the liver and spleen and the cytokines immunological profiles in the spleen were also investigated throughout the study. Furthermore, molecular approaches using quantitative Real Time PCR for DNA and RNA, respectively were carried out. Ours major results revealed the appearance of the many typical clinical laboratorial biomarkers in both strains. However, in general the wild strain was more able to induce a severe disease with fatal evolution mainly occurring in hamsters inoculated by the IC route. Anemia, leukopenia accompanied by neutropenia, lymphopenia, and in some cases monocytopenia and eosinopenia were the main hematological alteration found in hamsters that evolved into an active VL infection. Considering the biochemical parameters related to the renal function an increase in urea and creatinine in both strains, were detected. Regarding liver function, it was observed an increase in the levels of ALT and AST in different groups and times points evaluated. The installation of inflammatory process in the liver compartment occurred in the portal spaces with the evolution of infection, accompanied by the formation of granulomas, with higher frequency and intensity in the IC group. Hypoplasia of lymphoid follicles was associated with the macrophages proliferation in red pulp and the destruction of tissue architecture was more evident in the IC group. The qPCR showed a higher sensitive enough to detect the presence of DNA of L. infantum in both, spleen and liver, in all experimental groups (ID, IP and IC) independent of the strain used and the period evaluated. As observed in LDU index analysis, the qPCR also demonstrated that the higher parasitism in liver and spleen when the animals were infected with the wild strain by IC route. Moreover it was found a strong correlation between tissue parasitism and production of anti-IgG total L. infantum. The predominant expression of mRNA for IFN-in hamster infected with PP75 strain were detected at the end of evaluation in IC group, suggesting higher expression of this cytokine in response to the parasite replication inducing an intense concomitant inflammatory profile. The cytokine immune response observed in hamsters infected with the wild strain in the IC group during the initial period (3 months) was related to highly increased expression of IL-10 and TGF-hese finding appear to suggest suppression of these animals and the establishment of the active infection and parasitic tissue proliferation. In this sense, the inoculation by IC route is rapidly followed by a fulminating parasite proliferation and displaying a typical VL clinical signs similar of the pattern observed in humans or dogs. Taken together the results obtained in the present study, it is possible suggest the use of hamsters as experimental model to evaluate the immunopathological findings during ongoing active VL. Considering that the infected hamster presented many the clinicoimmunopathological features as observed in HVL and CVL we recommend this experimental model for preclinical evaluation of potential antileishmanial drugs and vaccine.
Description: Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto.
URI: http://www.repositorio.ufop.br/handle/123456789/3482
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