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Title: Metodologia para ensaios de candidatos vacinais contra leishmaniose visceral canina pelo co-cultivo de linfócitos e macrófagos infectados com Leishmania chagasi.
Authors: Viana, Kelvinson Fernandes
metadata.dc.contributor.advisor: Giunchetti, Rodolfo Cordeiro
Keywords: Vacinas
Leishmaniose visceral
Linfócitos
Macrófagos
Issue Date: 2012
Publisher: Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto.
Citation: VIANA, K. F. Metodologia para ensaios de candidatos vacinais contra leishmaniose visceral canina pelo co-cultivo de linfócitos e macrófagos infectados com Leishmania chagasi. 2012. 87 f. Dissertação (Mestrado em Biotecnologia) - Universidade Federal de Ouro Preto, Ouro Preto, 2012.
Abstract: Nos últimos 30 anos, a leishmaniose visceral (LV) tem avançado para áreas urbanas e periurbanas, apontando o cão como principal reservatório da L. chagasi (sin. L. infantum). Neste contexto, pesquisadores consideram como consenso que uma vacina contra a leishmaniose visceral canina (LVC) poderia ser uma importante ferramenta no controle tanto da leishmaniose humana como canina. Por esta razão, foi desenvolvido um novo método para avaliar o sistema imune de cães que poderia ser empregado como uma alternativa para se analisar imunogenicidade e níveis de proteção em candidatos vacinais contra a LVC. Para tanto, foram empregadas células mononucleares do sangue periférico CMSP de cães saudáveis para padronização de: (i) condições in vitro de cultivo de monócitos diferenciados em macrófagos de cães (MD-MC) infectados previamente com L. chagasi e avaliados após 3, 24, 48, 72 e 96h da infecção nos tempos de 2, 3, 4 e 5 dias de diferenciação do MD-MC (n=5 cães saudáveis); (ii) purificação de subpopulações de células T (CD4+ e CD8+) considerando a razão de linfócitos:macrófagos variando de 1:5 a 2:1 (n=12 cães saudáveis). Em todos os experimentos foram utilizados sobrenadante de cultura para analisar diferentes biomarcadores imunológicos, tais como: níveis de óxido nítrico, a produção de mieloperoxidase (MPO) e N-acetilglicosaminidase (NAG); citocinas do tipo 1 (IFN-, TNF-, IL-12), tipo 2 (IL-4) e imunomodulatórias (IL-10); e avaliada a frequência do parasitismo e carga parasitária em MD-MC infectados com L. chagasi. Os resultados revelaram que após 5 dias da diferenciação do MD-MC e 72h da infecção por L. chagasi foi observado um melhor perfil morfológico e da habilidade microbicida. Apesar dos níveis de NAG permanecerem praticamente inalterados, a análise do MPO revelou redução significativa no tempo de cinco dias de diferenciação dos MD-MC, indicando a baixa contaminação por granulócitos neste período. Os experimentos de co-cultivo empregando MD-MC e subpopulações de células T mostrou um perfil marcante nos biomarcadores imunológicos e na atividade microbicida, considerando a razão de linfócitos (CD4+ ou CD8+) : macrófagos de 1:2 e 1:1:1 de linfócitos (CD4+ e CD8+) : macrófagos. Assim, nestas condições do co-cultivo foi observado associação entre a produção de óxido nítrico e os níveis de citocinas do tipo 1, tipo 2 e imunomodulatórias com a manutenção de uma frequência de parasitismo intermediária e estabilização da carga parasitária em MD-MC infectados por L. chagasi. Os dados obtidos com a realização deste trabalho estimulam a continuidade dos estudos empregando esta metodologia de MD-MC co-cultivados com células T CD4+ e/ou CD8+ provenientes de CMSP de cães imunizados com candidatos vacinais contra LVC.
metadata.dc.description.abstracten: In the last 30 years, visceral leishmaniasis (VL) has moved to urban and peri-urban areas, highlighting the dog as the main reservoir of the L. chagasi (syn. L. infantum). In this context, researchers to consider as a consensus that a vaccine against canine visceral leishmaniasis (CVL) would be an important tool in the control of both human and canine visceral leishmaniasis. For this reason, we developed a new method for accessing the immune system of dogs that would be employed as the alternative for analyzing of immunogenicity and protection rate induced by vaccine candidates against CVL. For this purpose, we employed peripheral blood mononuclear cells (PBMC) of healthy dogs for standardizing the: (i) in vitro conditions of canine monocyte-derived macrophages (CM-DM) cultivation previously infected by L. chagasi and evaluated 3, 24, 48, 72 and 96 hours post-infection at the times two, three, four and five days of CM-DM differentiation (n=3 healthy dogs); (ii) the purification of T-cells subsets (CD4+ and CD8+); (iii) L. chagasi infected CM-DM co-cultured with purified T-cells subsets (CD4+ and/or CD8+) evaluated at a lymphocytes:macrophage ratio ranging from 1:5 to 2:1 (n=12 healthy dogs). In all the experiments we analyzed in the culture supernatant different immunological biomarkers, such as: nitric oxide levels, myeloperoxidase (MPO) and N-acetylglucosaminidase (NAG) production; type 1 (IFN-, TNF-, IL-12), type 2 (IL-4) and immunomodulatory (IL-10) cytokines; and described the frequency of parasitism and parasite load in L. chagasi-infected CM-DM. Our major data revealed that after five days and at 72h post L. chagasi-infection CM-DM presented a better pattern of both morphology of the culture and microbicidal ability. Besides the levels of NAG remained practically unchanged, MPO displayed a significant reduction at five days of CM-DM differentiation, indicating lower counts of granulocytes at this period. The CM-DM co-culture experiments using purified T-cells subsets showed an outstanding profile in the immunological biomarkers and microbicidal activity considering the lymphocytes (CD4+ or CD8+) : macrophages ratio of 1:2 and 1:1:1 for lymphocytes (CD4+ and CD8+):macrophages. In this sense, these conditions in the rate of co-culture revealed an association between nitric oxide production and the levels of type 1, type 2 and immunomodulatory cytokines with the maintenance of intermediated frequency in the parasitism and the stabilization of parasite burden in the L. chagasi-infected CM-DM. Our data stimulates to further analyze this methodology in CM-DM co-cultured with purified CD4+ and/or CD8+ T-cells from PBMC of dogs immunized with vaccine candidates against CVL.
URI: http://www.repositorio.ufop.br/handle/123456789/3457
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