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Title: Caracterização bioquímico-molecular de cepas de Saccharomyces cerevisiae isoladas de dornas de fermentação de cachaça para produção de cervejas.
Authors: Araújo, Thalita Macedo
metadata.dc.contributor.advisor: Brandão, Rogélio Lopes
Keywords: Saccharomyces cerevisiae
Cerveja
Leveduras - seleção
Levedos
Cachaça
Issue Date: 2013
Publisher: Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto.
Citation: ARAÚJO, T. M. Caracterização bioquímico-molecular de cepas de Saccharomyces cerevisiae isoladas de dornas de fermentação de cachaça para produção de cervejas. 2013. 95 f. Dissertação (Mestrado em Biotecnologia) - Universidade Federal de Ouro Preto, Ouro Preto, 2013.
Abstract: A cerveja é uma bebida alcoólica produto da fermentação do malte de cevada por leveduras que vem sendo produzida desde, aproximadamente, 6000 anos a.C. Além de gás carbônico e etanol, as leveduras produzem durante a fermentação, compostos secundários que são responsáveis pela formação do flavour e consequente qualidade sensorial da bebida. Por isso o uso de leveduras selecionadas tem sido um aspecto de grande importância na obtenção de bebidas. Na fabricação da cerveja, podem ser utilizadas leveduras do tipo ale ou lager, que pertencem à espécie Saccharomyces cerevisiae e Saccharomyces pastorianus, respectivamente. Estas espécies podem ser classificadas tanto por testes bioquímicos quanto por seu comportamento diferencial durante a fermentação. O Laboratório de Biologia Celular e Molecular (LBCM) do Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas (NUPEB) da UFOP conta com uma coleção de cepas de Saccharomyces cerevisiae isoladas a partir de dornas de fermentação de cachaça, as quais foram selecionadas por sua alta capacidade de produção de compostos voláteis e alta resistência a diferentes tipos de estresse. O presente trabalho objetivou a caracterização bioquímica e molecular de 21 cepas da coleção LBCM e a utilização de critérios de seleção visando à aplicação destas cepas à produção de cervejas. Das 21 cepas estudadas, 11 foram capazes de fermentar maltose, apresentando velocidade específica de crescimento semelhante em meio contendo glicose. A identificação molecular das cepas através da região ITS-5.8S do rDNA confirmou que 10 cepas pertencem à espécie S. cerevisiae. Dois grupos de testes foram aplicados posteriormente sobre as 10 cepas selecionadas e 4 cepas cervejeiras comerciais. O primeiro grupo de testes incluiu critérios de seleção baseados na classificação ale e lager, no perfil de floculação e na capacidade de crescer sob baixas temperaturas. O segundo grupo, incluiu testes complementares baseados na tolerância ao etanol, na produção de sulfeto de hidrogênio (H2S) e 4-vinilguaiacol (4-VG), no transporte de α-glicosídeos e na síntese de micocinas. Os resultados mostraram que três das 10 cepas estudadas foram capazes de fermentar melobiose e secretar melobiase, perfil característico de cepas tipo lager, embora todas as cepas tenham crescido a 37°C. Além disso, 9 foram capazes de crescer a 20°C e 7 a 15°C. Quanto ao perfil de floculação, 9 cepas apresentaram percentuais de floculação maior que 36% e responderam com um fenótipo New-Flo. A presença dos genes FLO1, FLO5 e FLO11 foi verificada por PCR e quantificada por qPCR, sendo relevante a presença dos genes FLO5 e FLO11 na maioria das cepas. Em geral, as cepas mais floculantes foram também as que apresentaram maior hidrofobicidade na sua superfície celular. Quanto aos testes complementares, as cepas apresentaram resistência a altas concentrações de etanol (20% (v/v)), baixa ou nenhuma produção de H2S (off flavour) e síntese de 4-VG em concentrações semelhantes às apresentadas pelas cepas comerciais tipo ale. Considerando a importância do consumo total dos açúcares presentes no mosto, em especial a maltotriose, o transporte de α-glicosídeos foi avaliado. As cepas apresentaram um transporte de α-glicosídeos semelhante aos valores revelados pelas cepas cervejeiras comerciais. Finalmente, as cepas foram submetidas a testes de produção e resistência a micocinas, considerando o uso de fermentações consorciadas. Os resultados revelaram que todas as cepas experimentais não são sensíveis, tampouco prejudiciais a outras espécies. Com base nos resultados dos testes complementares, foram selecionadas as cepas experimentais LBCM 45 e 78 para a produção de cervejas german pilsner e weissbier, respectivamente. As cervejas produzidas foram submetidas a análises físico-químicas, cujos resultados mostraram que as cepas em estudo, LBCM 45 e 78 apresentaram comportamento semelhante às cepas cervejeiras comerciais W-34/70 e WB-06. Portanto, os resultados do presente trabalho contribuíram para uma melhor caracterização da grande diversidade de linhagens de S. cerevisiae isoladas da produção de cachaça, visando sua potencial utilização na produção de outras bebidas alcoólicas fermentadas, tais como as cervejas, além da sua possível utilização em fermentações consorciadas.
metadata.dc.description.abstracten: Beer is an alcoholic beverage derived from fermentation of barley malt by yeasts that had been produced since approximately 6000 years BC. In addition to carbon dioxide and ethanol, during fermentation yeasts produce secondary compounds responsible for the flavour formation and consequent sensory quality of beer. The use of selected yeast has been an important aspect in beverages production. According to biochemical tests and differential behavior during wort fermentation, brewery yeast can be classified as ale or lager, which belongs to Saccharomyces cerevisiae and Saccharomyces pastorianus species, respectively. Our lab, LBCM, has a collection of S. cerevisiae strains isolated from fermentation yeasts of cachaça’s distilleries and selected for their high capacity of volatile compounds production and high resistance to different stress conditions. This study aimed to the biochemical and molecular characterization of 21 strains from LBCM collection as well to the use of selection criteria for their application to beer production. Among these 21 strains, 11 were able to ferment maltose presenting similar specific growth rate in media containing glucose. Molecular identification based on ITS-5.8S rDNA regions confirmed that 10 strains are S. cerevisiae. Two sets of tests were applied on 10 selected strains and 4 commercial brewery yeasts. The first group was based on ale and lager classification, flocculation profile and low temperature fermentation. The second one included additional testes such as ethanol tolerance, H2S and 4-VG production, α-glucosides transport and synthesis of killer toxins. The results showed that three from 10 strains were able to ferment melibiose and to secret melibiase, a typical lager profile, even though all strains grew at 37°C. In addition, 9 were able to grow at 20°C and 7 at 15°C. Nine strains showed flocculation percentages greater than 36% consistent with the NewFlo-phenotype. The flocculation genes FLO1, FLO5 and FLO11 were detected by PCR and their relative expression was quantified by qPCR. FLO5 and FLO11 were detected in most of the strains. Genetic products corresponding to repetitive central regions of FLO5 and FLO11 genes were detected in most of the strains. A relationship between flocculation profile and surface hydrophobicity was observed. Regarding to additional tests, strains showed resistance to high concentrations of ethanol (20% (v / v)), low or no hydrogen sulfide production (off flavor) and 4-vinilguaiacol synthesis in concentrations similar to ale commercial strains. Considering the importance of total consumption of sugars present in the wort, particularly maltotriose, we evaluated α-glycosides transport. The strains showed α-glycosides transport rate similar to brewery commercial ones. Finally, the strains were tested for killer toxins production and resistance, considering the possibility of fermentation consortium. The results showed that all strains are not sensitive and unable to produce killer toxins. Based on the results of additional tests, we selected LBCM 45 and LBCM 78 strains to beer production. Physical and chemical assays revealed similar patterns between beers produced by each selected strain and the corresponding commercial strain. Therefore, this study contributed to a better characterization of the diversity of natural S. cerevisiae strains isolated from cachaça production environments and reveals their potential use in other fermented products like beer as well as a possible use in fermentation consortiu
URI: http://www.repositorio.ufop.br/handle/123456789/2937
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