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Title: Peptídeos ligantes de células tumorais e de imunoglobulinas g específicos do câncer de mama.
Authors: Maia, Yara Cristina de Paiva
metadata.dc.contributor.advisor: Goulart Filho, Luiz Ricardo
Keywords: Mama - câncer
Clonagem - phage display
Peptídios - biopanming
Marcadores biológicos e tumor
Sensores eletroquímicos
Issue Date: 2011
Publisher: Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto.
Citation: MAIA, Y. C. de P. Peptídeos ligantes de células tumorais e de imunoglobulinas g específicos do câncer de mama. 2011. 113 f. Tese (Doutorado em Ciências Biológicas) - Universidade Federal de Ouro Preto, Ouro Preto, 2011.
Abstract: Até o momento, não existem biomoleculares que sejam efetivamente utilizados no diagnóstico do câncer de mama. Uma alternativa para auxiliar a busca por marcadores moleculares é baseada na seleção de ligantes de alta afinidade por meio de Phage Display (PD). O principal objetivo desta tese foi o desenvolvimento de novos biomarcadores envolvidos no câncer de mama selecionados contra uma linhagem celular tumoral altamente agressiva e contra IgG purificada específica de tecido mamário de pacientes. Após a seleção PD em biblioteca aleatória de peptídeos, todos os clones imunorreativos foram caracterizados por sequenciamento, deduzidos in vitro e submetidos a análises in silico. Validações posteriores foram conduzidas com ELISA e análise histopatológica. Apesar de terem sido relatadas diversas variações da metodologia, a maior parte dos processos de seleção usou ligantes obtidos depois de três ciclos de seleção. Os marcadores relatados na literatura foram pouco explorados devido à complexidade dos processos de validação. Este trabalho demonstrou que as seleções do primeiro e segundo ciclos são viáveis e podem ser utilizadas para aumentar o número de potenciais marcadores a serem testados. Os resultados com linhagem de células tumorais identificaram três potenciais marcadores no terceiro ciclo de seleção, dos quais foi selecionado aquele com melhor relação de absorbância tumor/controle no ELISA para síntese química. O peptídeo sintético foi associado com uma marcação menos intensa em tumores triplo negativos (Receptor de Estrógeno, Receptor de Progesterona e ErbB2). Outros peptídeos do segundo ciclo também demonstraram especificidade a tecidos tumorais. Para a estratégia de mapeamento de antígenos contra IgG purificada específica de tecido mamário, um peptídeo (F4) pode reconhecer tanto tecidos tumorais de mama quanto IgG circulante. Ambos clone F4 e peptídeo sintético SF4 alcançaram diagnóstico de alta acurácia, mas surpreendentemente, o clone F4 apresentou a melhor sensibilidade e especificidade (77,8% e 85,7%, respectivamente), sugerindo que pode ser utilizado no diagnóstico para triagem precoce de câncer de mama, anterior às análises por imagem e patológicas. A identificação e caracterização do biomarcador putativo está em investigação por meio de seleção combinatorial de anticorpos scFv contra o fago F4 e o peptídeo SF4, os quais serão utilizados para captura imunológica do antígeno verdadeiro e para análise por espectrometria de massas. Um sensor eletroquímico de baixo custo utilizando o peptídeo SF4 também foi desenvolvido.
metadata.dc.description.abstracten: Currently there are no biomarkers that have effectively been used in breast cancer (BC) diagnosis, which has been accomplished mainly based on mammography and pathological analysis of biopsy specimens. An alternative technology for the discovery of markers is through selection of high affinity ligands by Phage Display (PD). The main objective of this investigation was the development of new biomarkers involved in breast cancer that were selected against a highly aggressive tumor cell lineage and against purified tissue-specific IgG from BC patients. After PD selections of random peptide libraries, all immunoreactive ligands were further characterized by sequencing, in vitro translated and submitted to bioinformatic analyses. Further validations were performed by ELISA and immunohistochemistry. Although many variations of the methodology have been reported, most of the selection processes have used ligands obtained after three or more cycles of selection, but successful markers have been marginally explored due to complex validation processes. We have demonstrated that selections in the first and second cycles are feasible and can be used to increase the number of potential markers to be tested. Furthermore, results from the tumor cell lineage also identified three potential peptide markers in the third cycle that presented the best relation was chosen for peptide synthesis. The synthetic peptide was associated to less intense labeling of triple negative tumors (Estrogen Receptor, Progesterone receptor, and ErbB2). Other peptides from the second cycle also seemed very specific to tumor tissues. For the antigen mapping strategy against purified tissue-specific IgG from patients’ tumor biopsies, one peptide (F4) could recognize both breast tumor tissues as well as circulating IgG from patients. Both F4 clone and its synthetic peptide reached a very high accurate diagnosis, but surprisingly, the selected F4 clone presented the highest sensitivity and specificity, (77.8% and 85.7%, respectively), suggesting that it can be used as a diagnostic reagent for early BC screening prior to imaging and pathological analyses. Identification and characterization of the putative biomarker is under investigation through Fab combinatorial antibody selection against both F4 clone and peptide, which will be used for immunological capture of the true antigen and for mass spectrometry analysis. A low cost electrochemical sensor using the SF4 peptide was also developed.
URI: http://www.repositorio.ufop.br/handle/123456789/2920
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