Avaliação, in vitro, da resposta imune de neutrófilos de camundongos C57BL/6 estimulados com diferentes espécies de Leishmania.

Abstract

Neutrófilos prevalecem nas primeiras horas após a infecção por Leishmania e representam, portanto, a primeira população celular a migrar para o local do inóculo, sendo cerca de 80 a 90% do infiltrado celular e, dessa forma, pode contribuir para resposta imune protetora na infecção por este parasito. Entretanto, diferentes estudos mostraram que neutrófilos podem auxiliar no estabelecimento da infecção, via inativação dos mecanismos leishmanicidas de macrófagos. Considerando que a maior parte dos trabalhos aborda a infecção por Leishmania major, torna-se de grande relevância o estudo do papel de neutrófilos na infecção por outras espécies de Leishmania. Neste sentido foi avaliada, in vitro, a resposta imune de neutrófilos na presença de diferentes espécies de Leishmania. Para isso, neutrófilos obtidos de medula óssea de camundongos C57BL/6 e isolados por gradiente de Percoll® foram cultivados na presença de Leishmania amazonensis, Leishmania braziliensis ou L. major, por 3 horas a 37°C / 5%CO2. Primeiramente, foi avaliada a viabilidade dos neutrófilos infectados por parasitos do gênero Leishmania, onde os resultados mostraram que o percentual de células viáveis não foi alterado, independentemente da espécie de Leishmania. Em seguida, foi avaliada a capacidade fagocítica através da marcação dos parasitos com éster de succinimidil-carboxifluoresceína (CFSE) e os resultados mostraram maior percentual de fagocitose de L. braziliensis por neutrófilos quando comparados a L. amazonensis ou L. major. Posteriormente, foi avaliado o perfil funcional dessas células através da avaliação da expressão de óxido nítrico (NO) e espécies reativas de oxigênio (EROs) intracelulares, por citometria de fluxo, e os resultados demonstraram maior expressão tanto de NO como de EROs por neutrófilos infectados por L. braziliensis quando comparados a L. amazonensis ou L. major. Adicionalmente, foi avaliado a expressão de moléculas de ativação (CD11b/CD49d/CD62L e TLR2/TLR4/TLR9) e os resultados mostraram diminuição da expressão de CD62L e aumento na expressão de TLR2 e TLR9 em neutrófilos infectados pelas três espécies de Leishmania. Além disso, foi observado aumento na expressão de TLR4 em neutrófilos infectados por L. braziliensis, quando comparado à população sem estimulo, bem como, aumento de TLR2 quando comparado com as demais espécies. Posteriormente foi realizada a dosagem dos níveis de quimiocinas (MCP-1, MCP-3, MIP-1α, MIP-1β e RANTES) no sobrenadante de cultura e os resultados mostraram que apenas neutrófilos infectados por L. amazonensis ou L. braziliensis produziram MIP-1α, além disso, independente do estímulo, neutrófilos foram capazes de produzir MIP-1β. Por fim, os resultados da avaliação do perfil de expressão intracelular das citocinas IL-12, TNF-α, IL-10 e TGF-β mostraram maior expressão de TNF-α por neutrófilos infectados pelas três espécies do parasito. Além disso, esse mesmo resultado foi observado em neutrófilos expressando IL-10 infectados por L. amazonensis ou L. braziliensis, bem como, em neutrófilos expressando IL-12p40 infectados por L. amazonensis, quando comparados aos neutrófilos sem estímulo. Nenhuma diferença foi observada para a citocina TGF-β nos neutrófilos infectados pelas três espécies do parasito. Em conjunto, os dados demonstraram que neutrófilos podem ter papel importante para o controle da infecção, bem como no estabelecimento e direcionamento de resposta protetora. Além disso, pode-se sugerir que L. braziliensis foi mais eficiente na indução de perfil de ativação e expressão de mediadores inflamatórios quando comparado às demais espécies, o que indica um possível mecanismo de controle da infecção desencadeado por neutrófilos.