Please use this identifier to cite or link to this item: http://www.repositorio.ufop.br/handle/123456789/2716
Title: Identificação, classificação e anotação de enzimas desubiquitinadoras e ubiquitina-símile em Trypanosoma cruzi.
Authors: Olmo, Roenick Proveti
metadata.dc.contributor.advisor: Cota, Renata Guerra de Sá
Keywords: Trypanosoma cruzi
Ubiquitina
Enzimas
Doença de Chagas
Genoma - leishmania major
Issue Date: 2009
Publisher: Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto.
Citation: OLMO, R. P. Identificação, classificação e anotação de enzimas desubiquitinadoras e ubiquitina-símile em Trypanosoma cruzi . 2009. 121 f. Dissertação (Mestrado em Ciências Biológicas) - Universidade Federal de Ouro Preto, Ouro Preto, 2009..
Abstract: O sequenciamento do genoma de Leishmania major, Trypanosoma cruzi e T. brucei mostrou que cada genoma contém entre 8300-1200 genes que codificam proteínas, dos quais aproximadamente 6500 são comuns entre estas espécies. Neste estudo nós focamos a busca nos bancos de dados de tripanossomatídeos por proteínas envolvidas com o metabolismo de ubiquitina. Existem basicamente nove subfamílias distintas de enzimas envolvidas com esta via, denominadas DUBs: ubiquitina C-terminal hidrolases (UCHs), proteases específicas ao processamento de ubiquitina (USPs), proteases relacionadas à doença de Machado-Joseph (MJDs), proteases de tumor ovariano, também chamadas otubaínas (OTUs), proteases com motivo JAMM, sentrinas, autofaginas, peptidases semelhantes à papaína de vírus de RNA de fita dupla e eucariotas (PPPDEs), e metaloproteases Wss1p-símile (WLMs). Neste trabalho nós utilizamos ferramentas de bioinformática para identificar esse repertório de enzimas nos bancos de dados públicos de genomas das espécies L. infantum, L. major, L. braziliensis, T. brucei e T. cruzi. Nossa pesquisa in silico obteve 163 possíveis entradas que codificam para DUBs nestas espécies quando comparadas por BLASTx à proteínas ortólogas conhecidas no GenBank. Destas, 84 pertenciam à subfamília USP, 10 à JAMM, 10 à UCH, 15 à OTU, 5 à sentrina, 24 à PPPDE, 10 à autofagina, 5 à WLM, e não foram encontradas sequências correspondentes à MJD. No genoma do T. cruzi foi também observado a presença de genes duplicados, onde 63 entradas puderam ser resumidas, com no mínimo 95% de similaridade, à 34 entradas. No entanto, em cada genoma de Leishmania estudado foram encontrados em média 32 entradas para DUBs, e sua maioria possuindo ortólogos no mesmo gênero. Análises comparativas dos genes responsáveis pela remoção de ubiquitina mostraram diferenças significativas nos tamanhos das suas sequências de nucleotídeos bem como em suas composições de aminoácidos, especialmente nas regiões não cobertas por domínios conservados, sugerindo que há manutenção da função, mas diferente especificidade aos substratos. Além disso, a expressão relativa dos genes TcUSP7, -10, -14, -15 e TcUCH-L3 determinadas por RT-qPCR mostraram perfis similares de expressão em formas epimastigotas das cepas Berenice-62, Berenice-78, Colombiana e Y do T. cruzi. No entanto, os níveis de TcUSP15 foram menores quando comparados às outras cepas analisadas neste estudo, enquanto os níveis de TcUCH-L3 foram os maiores. Finalmente, nós determinamos a atividade DUB utilizando o substrato CBZ-Gly-Gly- Arg-7-amido-4-metilcumarina em extratos nucleares e citosólicos e a conjugação de proteínas com ubiquitina e SUMO nos mesmos extratos utilizando western blot e anticorpos específicos para ubiquitina e SUMO. Nossos resultados mostraram que a atividade é predominantemente citosólica. A técnica de western blotting mostrou que os conjugados ubiquitinados são preferencialmente encontrados no citoplasma e os sumorilados no núcleo. Esses resultados evidenciam a complexidade e diversidade das DUBs em tripanossomatídeos e abre a possibilidade de explorar a relevância das interações na regulação das vias mediadas por ubiquitina nesses parasitos.
metadata.dc.description.abstracten: The genome sequences of Leishmania major, Trypanosoma brucei and T. cruzi revealed that each genome contains 8300-12000 protein-coding genes, of which approximately 6500 are common to their genomes. In this study we focused the mining the trypanosomatid databases looking for proteins involved in ubiquitin metabolism. There are basically nine distinct subfamilies of enzymes involved in this pathway, denominated DUBs: ubiquitin C-terminal hydrolases (UCHs), ubiquitin-specific processing proteases (USPs), Machado-Joseph disease proteases (MJDs), ovarian tumour proteases (OTUs), JAMM motif proteases, sentrins, autophagins, Permuted Papain fold Peptidases of DsRNA viruses and Eukaryotes (PPPDEs), and Wss1p-like metalloproteases (WLMs). In this work we used bioinformatic approaches to identity these set of enzymes in L. infantum, L. major, L. braziliensis, T. brucei and T. cruzi public genome databases. Our in silico search retrieved 163 putative entries coding to DUBs in these species among databases when compared to known GenBank ortholog proteins through BLASTx. Of these, 84 belong to USP subfamily, 23 to JAMM, 10 to UCH, 15 to OTU, 5 to sentrin, 24 to PPPDE, 10 to autophagin, 5 to WLM, and where not found entries to MJD. In T. cruzi genome was also observed the presence of duplicated genes, where the 63 entries might be resumed, with at least 95% of similarity, in 34 sequences. However, in each Leishmania genome studied were found on average 32 entries for DUBs, and most of them have its orthologues into the same genus. Comparative analysis of genes responsible for ubiquitin removal showed significant difference in their respective nucleotide sequence lengths as well as amino acid composition, especially with regards to regions outer conserved domains, suggesting maintaining of function, but different substrate specificity. In addition, the relative gene expression of TcUSP7, -10, -14, -15 and TcUCH-L3 determined by RT- qPCR showed similar profile in epimastigotes forms between Berenice-62, Berenice-78, Colombian and Y strains of T. cruzi. However, the levels of TcUSP15 were lowest when compared to strains analyzed in this study, while the levels of TcUCH-L3 where highest. Finally, we determinate the DUB activity using the substrate CBZ-Gly-Gly- Arg-7-amido-4-methylcoumarin in nuclear and citosolic extracts and the ubiquitin and SUMO protein conjugation in the same extracts using western blot and specific antibody to ubiquitin and SUMO. Our results showed that the activity were predominantly citosolic. The western blotting showed that preferentially conjugate ubiquitin was found in the cytoplasm and sumoylation in the nucleus. These results evidence the complexity and diversity of DUBs in tripanosomatids and open the possibility to explore the relevance of their interactions in regulation of ubiquitin- mediated pathways in these parasites.
URI: http://www.repositorio.ufop.br/handle/123456789/2716
Appears in Collections:PPCBIOL - Mestrado (Dissertações)

Files in This Item:
File Description SizeFormat 
DISSERTAÇÃO_IdentificaçãoClassificaçãoAnotação.PDF23,62 MBAdobe PDFView/Open


Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.