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Title: Caracterização biológica, bioquímica e molecular em isolados de Leishmania infantum obtidos de cães naturalmente infectados : uma busca racional de biomarcadores de virulência e patogenicidade.
Authors: Braga, Samuel Leôncio
metadata.dc.contributor.advisor: Reis, Alexandre Barbosa
Keywords: Leishmania infantum
Isoenzimas
Virulência - microbiologia
Patogenicidade
Leishmaniose visceral canina
Issue Date: 2011
Publisher: Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto.
Citation: BRAGA, S. L. Caracterização biológica, bioquímica e molecular em isolados de Leishmania infantum obtidos de cães naturalmente infectados : uma busca racional de biomarcadores de virulência e patogenicidade . 2011. 84 f. Dissertação (Mestrado em Biotecnologia) - Universidade Federal de Ouro Preto, Ouro Preto, 2011..
Abstract: No Brasil, a Leishmaniose Visceral Canina (LVC) é causada por Leishmania infantum e os cães tem sido considerados como os principais responsáveis pela dispersão da doença. A LVC pode se manifestar com diferentes formas clínicas, variando desde uma infecção de caráter assintomático até uma forma sintomática grave, a qual na maioria das vezes culmina com a morte dos animais. O presente estudo empregou ferramentas biotecnológicas para avaliar características biológicas, bioquímicas e genéticas em dez cepas de Leishmania spp. isoladas de cães naturalmente infectados, portadores de diferentes formas clínicas (assintomática ou sintomática) da LVC, buscando identificar fenótipos de virulência e patogenicidade. Todos os isolados obtidos foram submetidos às seguintes avaliações: (i) comportamento em meio de cultivo (LIT); (ii) infectividade e patogenicidade mediante infecção experimental no modelo hamster (Mesocricetus auratus); (iii) análise bioquímica por meio de perfil de isoenzimas; (iv) identificação da espécie de Leishmania por PCR-RFLP; (v) RAPD-PCR para identificação de possíveis polimorfismos genéticos. Os resultados demonstram que os isolados de Leishmania obtidos de cães com ambas formas clínicas, apresentam fenótipos de crescimento diferenciados. Apesar da baixa taxa de infectividade obtida pela infecção experimental em hamster, foi possível selecionar dois isolados (I-3 e I-8), com diferentes potencias de infectividade quando comparados aos demais isolados e a cepa de referência L. infantum (MHOM/BR/74/PP75). As análises dos perfis enzimáticos (G6PD, IDH, GDH, MDH, ME e 6PGD), demonstraram que os isolados obtidos tanto de cães sintomáticos como assintomáticos apresentam padrões similares em relação ao número e migração das bandas eletroforética quando comparados com a cepa de referência de L. infantum. A PCR-RFLP demonstrou que nove isolados apresentaram perfil idêntico ao observado para cepa de referência de L. infantum, enquanto um isolado apresentou perfil semelhante ao da espécie L. amazonensis. Com o intuito de identificar características genéticas entre os isolados, que pudessem ser associadas com as formas clínicas da LVC foi empregada a técnica de PCR-RAPD. Os resultados obtidos permitiram a construção de um fenograma consenso gerado pelos iniciadores (M13-40F, QG1, L15995, K7, P53-1), demonstraram que maioria dos isolados apresentavam perfil genético semelhante ao da cepa de referência de L. infantum, sem diferenças significativas entre isolados obtidos de cães sintomáticos e assintomáticos. O conjunto de resultados obtidos no presente estudo vem contribuindo para um melhor entendimento das características biológicas, bioquímicas e genéticas de cepas de L. infantum oriundas de cães naturalmente infectados, portadores de diferentes formas clínicas da LVC.
metadata.dc.description.abstracten: In Brazil, Canine Visceral Leishmaniasis (CVL) is caused by Leishmania infantum parasites and infected dogs have been the ones responsible for the spread of the disease in large Brazilian cities. CVL manifests itself as a broad clinical spectrum ranging from asymptomatic infection to patent severe disease, which mostly culminates on death. The main goal of this work was the employment of biotechnological tools to evaluate biochemical and genetic profiles of ten Leishmania spp. strains, isolated from naturally-infected dogs presenting the asymptomatic and symptomatic clinical forms of the disease. Our major focus was the identification of phenotypes associated to virulence and pathogenicity. To accomplish this goal all isolates underwent the following assessments: (i) evaluation of parasite growth in culture medium (LIT); (ii) measurement of parasite infectivity and pathogenicity in the hamster model; (iii) determination of the iso-enzymatic profile; (iv) PCR-RFLP for species identification, and (v) RAPD-PCR for identification of possible genetic polymorphisms. Our results revealed that all isolates from both asymptomatic and symptomatic groups exhibited different in vitro growth curves. Despite the low rate of infectivity in the experimental hamster model of infection, we have selected two strains (I-3 and I-8) with differing potential for infection when compared to the reference L. infantum (MHOM/BR/74/PP75) and to other isolates. Analyses of the enzymatic systems (G6PD, IDH, GDH, MDH, ME and 6PGD) employed herein demonstrated that the isolates from symptomatic and asymptomatic dogs presented similar patterns in respect to the number of bands and electrophoretic profile when compared to the L. infantum reference strain. The PCR- RFLP technique revealed that nine out of ten isolates presented a RFLP profile identical to the L. infantum reference strain. For the remaining isolate, a RFLP profile similar to the L. amazonensis species was obtained. At last, RAPD-PCR analyses of the isolates enabled the construction of a consensus phenetic tree generated using five primers (M13-40F, QG1, L15995, K7, P53-1). In this experiment we demonstrated that most isolates displayed genetic profiles similar to the L. infantum reference strain, with no meaningful distinction between the isolates from symptomatic and asymptomatic dogs. The data obtained in this study have contributed to a better understanding of the biological, biochemical and genetic profiles of L. infantum strains isolated from naturally-infected dogs with different clinical forms of CVL.
URI: http://www.repositorio.ufop.br/handle/123456789/2703
Appears in Collections:PPBIOTEC - Mestrado (Dissertações)

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