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Title: Clonagem do cDNA codificante para a toxina madura LTx5 da aranha Lasiodora sp no vetor pYES2.1/V5-His-TOPO® e expressão da proteína recombinante.
Authors: Batista, Thiago Mafra
metadata.dc.contributor.advisor: Castro, Ieso de Miranda
Keywords: Toxinas
Clonagem
Aranha - veneno
Biologia molecular
Issue Date: 2009
Publisher: Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto.
Citation: BATISTA, T. M. Clonagem do cDNA codificante para a toxina madura LTx5 da aranha Lasiodora sp no vetor pYES2.1/V5-His-TOPO® e expressão da proteína recombinante. 2009. 80 f. Dissertação (Mestrado em Ciências Biológicas) - Universidade Federal de Ouro Preto, Ouro Preto, 2009.
Abstract: O estudo de toxinas presentes em venenos de animais vem apresentando crescimento contínuo. O veneno da aranha do gênero Lasiodora sp, popularmente conhecida como caranguejeira, ainda é pouco explorado. Neste trabalho, nós sub clonamos a sequencia codificante para a toxina madura LTx5 no vetor de expressão pYES2.1/V5-HIS-TOPO® (Invitrogen) em fusão com um V5 epitope e uma cauda de histidina. A LTx5 foi previamente identificada através da varredura de uma biblioteca de cDNA da glândula de veneno da aranha Lasiodora sp. Após confirmação da clonagem por PCR de colônias e cortes do DNA plasmidial com endonucleases de restrição, realizamos o sequenciamento de ambas as fitas do DNA e verificamos que o inserto foi inserido no frame correto. A expressão da proteína recombinante foi realizada utilizando células de Saccharomyces cerevisiae W303-1A. Alcançamos uma melhor expressão da proteína recombinante LTx5 quando as células foram pré-cultivadas em meio contendo rafinose, e induzidas em meio contendo 4% de galactose (p/v). A imunodetecção da proteína recombinante LTx5 contendo a cauda de histidina utilizando anticorpo monoclonal anti His-Tag só foi possível em ensaios de Dot Blot. O tratamento no qual as proteínas são submetidas em um ensaio de Western Blot parece interferir na ligação antígenoanticorpo. Não alcançamos sucesso nos procedimentos de purificação testados devido ao baixo rendimento de expressão da proteína. A presença de códons raros na sequencia codificante para a toxina LTx5 e a toxicidade da molécula para as células de Saccharomyces cerevisiae parecem afetar negativamente o rendimento da expressão da proteína. Sugerimos que os estudos futuros com esta toxina sejam realizados utilizando um sistema mais eficiente para a expressão da proteína.
metadata.dc.description.abstracten: The study of toxins present in venoms of animals has shown continuous growth. The venom of the spider genus Lasiodora sp, popularly known as caranguejeira is still little explored. In this study, we sub-cloned the coding sequence for the mature toxin LTx5 at the expression vector pYES2.1/V5-HIS-TOPO® (Invitrogen) in fusion with a V5 epitope and a histidine tag. The LTx5 was previously identified through the screening of a cDNA library of the spider Lasiodora sp venom gland. The presence of the appropriate insert was determined using colonies PCR, digestion with restriction endonucleases and sequencing of both DNA strands. The expression of recombinant protein was performed using Saccharomyces cerevisiae W303-1A cells. Improved expression levels of recombinant protein LTx5 were reached when the cells were precultured in medium containing raffinose, and induced in medium containing 4% galactose (w/v). The recombinant protein LTx5 containing the histidine tag by using monoclonal anti His-tag was only detected in of Dot Blot assay. The treatment in which proteins are subjected during a Western blot test appears to negatively interfere in the antigen-antibody binding. Success in the purification procedures was not achieved due to the low expression of the protein. The presence of rare codons in coding sequence for the LTx5 toxin and its toxicity to the Saccharomyces cerevisiae cells appear to negatively affect the efficiency of the protein expression. We suggest that further studies must take in consideration the use of more efficient system for the expression of the peptide.
URI: http://www.repositorio.ufop.br/handle/123456789/2698
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