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Title: Avaliação da imunogenicidade de dois novos Imunobiológicos candidatos a vacina contra Leishmaniose visceral canina.
Authors: Giunchetti, Rodolfo Cordeiro
metadata.dc.contributor.advisor: Reis, Alexandre Barbosa
Keywords: Leishmaniose visceral canina
Vacinas
Issue Date: 2007
Publisher: Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto.
Citation: GIUCHETTI, R. C. Avaliação da imunogenicidade de dois novos Imunobiológicos candidatos a vacina contra Leishmaniose visceral canina. 2007. 179 f. Dissertação (Mestrado em Ciências Biológicas) - Universidade Federal de Ouro Preto, Ouro Preto, 2007.
Abstract: Considerando a importância de estratégias imunoprofiláticas para o controle da leishmaniose visceral, a inexistência de drogas capazes de curar cães infectados e o aumento de casos de resistência aos antimoniais pentavalentes, o presente trabalho buscou avaliar a imunogenicidade de dois novos imunobiológicos candidatos a vacina contra leishmaniose visceral canina (LVC). Observa-se uma lacuna em estudos que buscam avaliar a imunogenicidade pós-vacinal de imunobiológicos anti-LVC. Assim, o presente estudo propôs uma análise detalhada da imunogenicidade considerando diversos biomarcadores da resposta imune celular e humoral após as três doses das diferentes estratégias vacinais. Trinta e cinco cães sem raça definida foram subdivididos em sete grupos experimentais, entre os quais: (i) grupo controle C (n = 10) que recebeu 1 mL de salina estéril a 0,9%; (ii) grupo LB (n = 5) que recebeu 600 μg de proteína de Leishmania braziliensis em 1 mL de salina estéril a 0,9%; (iii) grupo Sap (n = 5) que recebeu 1 mg de saponina em 1 mL de salina estéril a 0,9%; (iv) grupo LBSap (n = 5) que recebeu 600 μg de proteína de L. braziliensis associado a 1 mg de saponina em 1 mL de salina estéril a 0,9%; (v) grupo Sal (n = 5) que recebeu extrato de glândula salivar de Lutzomyia longipalpis (SGE) equivalente ao conteúdo de 5 ácinos da glândula salivar em 1 mL de salina estéril a 0,9%; (vi) grupo LBSal (n = 5) que recebeu 600 μg de promastigotas de L. braziliensis associado ao SGE em 1 mL de salina estéril a 0,9%; (vii) grupo LBSapSal (n = 5) que recebeu 600 μg de promastigotas de L. braziliensis associado a 1 mg de saponina e ao SGE em 1 mL de salina estéril a 0,9%. Cada animal recebeu três aplicações subcutâneas no flanco esquerdo em intervalos de quatro semanas. Os resultados indicam que a saponina quando presente (Sap, LBSap, LBSapSal) induziu em alguns cães a formação de edema ou de pequeno nódulo local, sem apresentar lesões ulceradas ou outras alterações adversas. A avaliação da inocuidade e toxicidade das diferentes vacinas não revelou contra-indicações para utilização. A avaliação da resposta humoral revelou que os grupos LBSap e LBSapSal apresentaram aumento dos níveis de IgG total, IgG1 e IgG2 anti-Leishmania, sugerindo um perfil de resposta imune misto Th1/Th2. De forma semelhante, no grupo LBSapSal foi observado aumento dos níveis de IgG total, IgG1 e IgG2 anti-SGE, que tem sido previamente relacionado ao estabelecimento de uma resposta imune protetora anti- Leishmania. Além disto, experimentos utilizando Western blot para avaliar a reatividade de anticorpos caninos anti-proteínas do SGE evidenciaram o predomínio de proteínas com peso molecular de 35, 45 e 75 KDa, particularmente no grupo LBSapSal, sendo relacionado a um padrão de resistência contra infecção por Leishmania. A avaliação da resposta celular contou com o estudo imunofenotípico de células mononucleares do sangue periférico (PBMC) e revelou aumento do número de linfócitos B CD21+, linfócitos T CD5+ e das subpopulações T (CD4+ e T CD8+), indicando o estabelecimento de imunidade protetora contra infecção por Leishmania como previamente relatado na LVC. Além disto, foi observada pela análise in vitro redução do índice de proliferação utilizando VSA (vaccine soluble antigen) ou SLcA (soluble Leishmania chagasi antigen) nos grupos LB e Sal, enquanto os grupos LBSap e LBSapSal apresentaram aumento da atividade linfoproliferativa na presença de ambos os estímulos. De forma interessante, foi demonstrado no grupo Sal correlação negativa entre a atividade linfoproliferativa e linfócitos T CD4+ ou monócitos CD14+. Estes resultados permitem especular que a imunização realizada no grupo Sal poderia inibir a atividade de monócitos CD14+ em ativar linfócitos T CD4+ e assim reduzir a atividade linfoproliferativa. Por outro lado, PBMC cultivados in vitro com SLcA do grupo LBSap e com VSA ou SLcA no grupo LBSapSal apresentaram aumento da atividade XI linfoproliferativa acompanhada pela indução de linfócitos T CD8+ antígeno-específicos. Estes resultados sustentam a hipótese de que a vacinação com LBSap e LBSapSal estimularia o desenvolvimento de mecanismos imunoprotetores relacionados ao controle do parasitismo por Leishmania considerando a indução de linfócitos T CD8+ antígeno-específicos para proteínas relacionadas ao agente etiológico da LVC. A avaliação de potenciais células apresentadoras de antígenos (APC) revelou aumento do número de monócitos CD14+ circulantes nos grupos LBSap e LBSapSal. Além disto, altas contagens de APC foram associadas ao aumento da expressão de linfócitos MHC-I no grupo LBSap e de linfócitos CD80 e MHC-I no grupo LBSapSal, sugerindo que esta associação poderia representar a interação entre as respostas imunes inata e adaptativa, refletindo no aumento do perfil de ativação durante as imunizações. Os resultados obtidos pelas análises dos níveis de óxido nítrico (NO) pela avaliação dos níveis de nitrito no sobrenadante de cultura estimuladas com SLcA no grupo LBSap e no soro do grupo LBSapSal confirmam a hipótese de que estas vacinas induzem um perfil associado a resistência contra a infecção por Leishmania. Os resultados obtidos neste trabalho indicam que o potencial imunoprotetor induzido pelas vacinas LBSap e LBSapSal são compatíveis com o controle do agente etiológico da LVC.
metadata.dc.description.abstracten: Considering the importance of immunoprophylactic strategies for the control of visceral leishmaniasis, and the lack of studies concerning the cellular and humoral events that occur during vaccination in dogs, we have attempted to evaluate the immune response of a promising new vaccines candidate against canine visceral leishmaniasis (CVL). Thirty five mongrel dogs were treated within seven experimental groups as follow: (i) control group C (n = 10) received 1 ml of sterile 0.9% saline; (ii) LB group (n = 5) received 600 μg of Leishmania braziliensis promastigote protein in 1 ml sterile 0.9% saline; (iii) Sap group (n = 5) received 1 mg of saponin in 1 ml sterile 0.9% saline; (iv) LBSap group (n = 5) received 600 μg of L. braziliensis promastigote protein and 1 mg of saponin in 1 ml sterile 0.9% saline; (v) Sal group (n = 5) received sand fly gland extract (SGE) prepared from 5 acini of salivary glands of Lutzomyia longipalpis in 1 mL sterile 0.9% saline; (vi) LBSal group (n = 5) received 600 μg of L. braziliensis promastigote protein plus SGE in 1 mL sterile 0.9% saline; and (vii) the LBSapSal group (n = 5) received 600 μg of L. braziliensis promastigote protein plus 1 mg of saponin together with SGE in 1 mL sterile 0.9% saline. Each animal received three subcutaneous injections in the right flank at intervals of 4 weeks. The results obtained indicate that some dogs exhibit local swelling or mild local induration reactions, but no ulcerated lesions or other adverse reactions, after receiving saponin as an adjuvant (Sap, LBSap or LBSapSal groups). The overall tolerance of the candidate vaccines in dogs appeared to be adequate. The evaluation of immunogenicity revealed that animals treated with LBSap and LBSapSal presented higher (P < 0.05) amounts of anti- Leishmania total IgG that were associated with increased (P < 0.05) levels of IgG1 and IgG2, suggesting a mixed Th1/Th2 immune response. Likewise, LBSapSal elicited the production of elevated levels of anti-SGE total IgG, IgG1 and IgG2, that was previously associated in establishing an anti-immune L. chagasi response in human. Additionally, anti-SGE Western blot experiments showed predominance in the recognition of seric proteins with molecular weights of 35, 45 and 71 kDa, particularly following LBSapSal vaccination, and were related to the resistance pattern against Leishmania infection. The immunophenotypic evaluation in peripheral blood mononuclear cells (PBMC) reveal in the LBSap and LBSapSal increased (P < 0.05) counts of circulating CD21+ B-cells, CD5+ T-cells and CD4+ and CD8+ T-cell subset, suggesting protective immunity against Leishmania infection as has been suggested previously for CVL. Whilst lower stimulation index by either VSA (vaccine soluble antigen) or SLcA (soluble Leishmania chagasi antigen) were recorded for the LB and Sal groups, higher cell reactivities in the presence of both stumuli were related to LBSap and LBSapSal groups. Interestingly, a negative association was demonstrated between cell reactivity and CD4+ T-lymphocytes or CD14+ monocytes following in vitro stimulation in the Sal group. These data support the hypothesis that Sal treatment inhibits CD14+ monocytes in the promotion of CD4+ T-lymphocyte activation and the induction of cell proliferation. In contrast, when in vitro cultures of peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were stimulated with SLcA in the LBSap treatment and VSA or SLcA in the LBSapSal group, increased lymphoproliferation activity was accompanied by a higher frequency of antigen-specific CD8+ T-cells. These results support the hypothesis that induction of CD8+ T-cells may play a protective role in the mechanism of control of parasitism by Leishmania after LBSap and LBSapSal treatment associated with the antigen-specific immune response to antigens from the etiological agent of CVL. The evaluation of potential antigen presenting cells (APC) revealed increased numbers of circulating CD14+ monocytes in the LBSap and LBSapSal groups. Furthermore, the largest APC counts were associated XIII with the highest expression of MHC-I in lymphocytes in the LBSap and CD80 and MHC-I in lymphocytes in the LBSapSal, suggesting that this association could represent interaction between the innate and adaptive immune responses, reflecting an improvement in activation status during immunization. The results obtained from the analysis of nitric oxide (NO) levels (determined as nitrite) in culture supernatants stimulated by SLcA in the LBSap and in the serum of the LBSapSal confirmed the hypothesis that these vaccines induce a potential resistance profile against Leishmania infection. Our data suggested that the potential resistance profile elicited by LBSap and LBSapSal were compatible with effective control of the etiological agent of CVL.
URI: http://www.repositorio.ufop.br/handle/123456789/2697
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