Expressão heteróloga em sistema procarioto da NTPDase-1 do Trypanosoma cruzi e avaliação do potencial uso no imunodiagnóstico na doença de Chagas.

Abstract

Neste trabalho foram otimizados os tempos de indução e as concentrações de IPTG para se ter uma expressão de maiores quantidades de NTPDase-1 de T. cruzi recombinante. Além disso, avaliou-se as concentrações de cloreto de sódio necessárias para a obtenção de uma maior recuperação da NTPDase-1 de T. cruzi recombinante completa mais pura, já que ela apresentou menor pureza quando eluída com concentrações salinas recomendadas pelos fabricantes das resinas utilizadas. A diferença de purificação das proteínas recombinates em estudo completa e sem peptídeo sinal foi avaliada utilizado resinas contendo o íon metálico cobalto ou níquel. Sendo possível se ter proteínas mais puras com apenas uma purificação com resina contendo níquel, e necessitando de duas purificações consecutivas para se ter uma pureza semelhante quando se utilizou resina com cobalto. As frações solúveis e insolúveis NTPDase-1 de T. cruzi recombinante completa e sem peptídeo sinal foram purificadas e analisadas por eletroforese em gel SDS-PAGE 10% e western blotting. Sendo a purificação dos corpos de inclusão com baixíssima concentração protéica ou inexistente, foi viável purificar apenas o sobrendante para se ter uma maior concentração de proteínas para que fossem utilizadas nos testes de imunodiagnóstico. Os ensaios western blotting foram feitos para confirmar a presença da proteína recombinate. Além de ter sido possível, com esses ensaios, avaliar a possibilidade de um reconhecimento e clivagem do peptídeo sinal pela bactéria E. coli. Soros de cães experimentalmente positivos para T. cruzi cepas Berenice-78, Y e AAS, nas fases aguda e crônica da doença de Chagas, foram submetidos ao imunodiagnóstico por ELISA tomando como antígeno NTPDase-1 de T. cruzi recombinante completa ou sem peptídeo o sinal, sendo avaliado por anti-IgG conjugado à biotina. Foi possível perceber que não houve uma separação dos soros infectados e não infectados na fase aguda e crônica da doença utilizando-se a proteína recombinante. Esses resultados do imunodiagnóstico podem ter sido influenciados pela pureza do antígeno e pela conformação da proteína purificada.