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Title: Expressão heteróloga em sistema procarioto da NTPDase-1 do Trypanosoma cruzi e avaliação do potencial uso no imunodiagnóstico na doença de Chagas.
Authors: Araújo, Tatiana Dias
metadata.dc.contributor.advisor: Fietto, Juliana Lopes Rangel
Keywords: Trypanosoma cruzi
Imunodiagnóstico
Sal
Biologia molecular
Proteinas
Issue Date: 2008
Publisher: Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto
Citation: ARAÚJO, T. D. Expressão heteróloga em sistema procarioto da NTPDase-1 do Trypanosoma cruzi e avaliação do potencial uso no imunodiagnóstico na doença de Chagas . 2008. 99 f. Dissertação (Mestrado em Ciências Biológicas) - Universidade Federal de Ouro Preto, Ouro Preto, 2008.
Abstract: Neste trabalho foram otimizados os tempos de indução e as concentrações de IPTG para se ter uma expressão de maiores quantidades de NTPDase-1 de T. cruzi recombinante. Além disso, avaliou-se as concentrações de cloreto de sódio necessárias para a obtenção de uma maior recuperação da NTPDase-1 de T. cruzi recombinante completa mais pura, já que ela apresentou menor pureza quando eluída com concentrações salinas recomendadas pelos fabricantes das resinas utilizadas. A diferença de purificação das proteínas recombinates em estudo completa e sem peptídeo sinal foi avaliada utilizado resinas contendo o íon metálico cobalto ou níquel. Sendo possível se ter proteínas mais puras com apenas uma purificação com resina contendo níquel, e necessitando de duas purificações consecutivas para se ter uma pureza semelhante quando se utilizou resina com cobalto. As frações solúveis e insolúveis NTPDase-1 de T. cruzi recombinante completa e sem peptídeo sinal foram purificadas e analisadas por eletroforese em gel SDS-PAGE 10% e western blotting. Sendo a purificação dos corpos de inclusão com baixíssima concentração protéica ou inexistente, foi viável purificar apenas o sobrendante para se ter uma maior concentração de proteínas para que fossem utilizadas nos testes de imunodiagnóstico. Os ensaios western blotting foram feitos para confirmar a presença da proteína recombinate. Além de ter sido possível, com esses ensaios, avaliar a possibilidade de um reconhecimento e clivagem do peptídeo sinal pela bactéria E. coli. Soros de cães experimentalmente positivos para T. cruzi cepas Berenice-78, Y e AAS, nas fases aguda e crônica da doença de Chagas, foram submetidos ao imunodiagnóstico por ELISA tomando como antígeno NTPDase-1 de T. cruzi recombinante completa ou sem peptídeo o sinal, sendo avaliado por anti-IgG conjugado à biotina. Foi possível perceber que não houve uma separação dos soros infectados e não infectados na fase aguda e crônica da doença utilizando-se a proteína recombinante. Esses resultados do imunodiagnóstico podem ter sido influenciados pela pureza do antígeno e pela conformação da proteína purificada.
metadata.dc.description.abstracten: In this work were optimized the time of induction and the concentration of IPTG to get an expression of large quantities NTPDase-1 from the T. cruzi recombinant. Moreover, it was evaluate the concentrations of sodium chloride needed for a greter recovery of NTPDase-1 T. cruzi recombinant full purest, because it showed lower purity when eluted with salt concentrations recommended by manufacturers of resins used. The difference in purification of proteins recombinates study in full and without missing signal peptide was assessed used resins containing the metal ion cobalt or nickel. It is possible to have more pure protein with just a purification with resin containing nickel, and requiring two consecutive purificações to take a similar purity when using resin with cobalt. The soluble and insoluble fractions NTPDase-1 T. cruzi recombinant full and without signal peptide was purified and analyzed by gel electrophoresis 10% SDSPAGE and Western blotting. As the purification of inclusion bodies with very low protein concentration or non-existent, was the only viable purify sobrendante to have a higher concentration of protein to be used in tests of immunodiagnosis. Tests western blotting were performed to confirm the presence of the protein recombinate. Besides being possible, with these tests, assess the possibility of a recognition and signal peptide cleavage of the bacterium E. coli. Serum of dogs experimentally positive for T. cruzi strains Berenice-78, Y and AAS in acute and chronic stages of Chagas disease, were submitted to immunoreactivity by ELISA taking as NTPDase-1 antigen of T. cruzi recombinant full or without the signal peptide, being evaluated by anti-IgG conjugated to biotin. It was possible to see that there was a separation of sera infected and uninfected with acute and chronic disease using the recombinant protein without the signal peptide. These results of immunodiareactivity may have been influenced by the purity of the antigen and the conformation of the protein purified.
URI: http://www.repositorio.ufop.br/handle/123456789/2695
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