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Title: Estratégia para a identificação de proteína(s) quinase(s) envolvida(s) na ativação da H+- ATPase de membrana plasmática de Saccharomyces cerevisiae.
Authors: Pereira, Renata Rebeca
metadata.dc.contributor.advisor: Brandão, Rogélio Lopes
Keywords: Saccharomyces cerevisiae
Membranas - biologia
Leveduras
Glicose
Biologia molecular
Issue Date: 2011
Publisher: Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto.
Citation: PEREIRA, R. R. Estratégia para a identificação de proteína(s) quinase(s) envolvida(s) na ativação da H+- ATPase de membrana plasmática de Saccharomyces cerevisiae. 2011. 99 f. Dissertação (Mestrado em Ciências Biológicas) - Universidade Federal de Ouro Preto, Ouro Preto, 2011.
Abstract: A H+-ATPase de membrana plasmática de Saccharomyces cerevisiae é uma bomba de prótons que possui um papel importante na fisiologia deste microrganismo, uma vez que ativada é capaz de criar um gradiente eletroquímico que é essencial para a captação de nutrientes. A presença de glicose desencadeia modificações pós-traducionais que aumentam a atividade da H+-ATPase. Trabalhos realizados em nosso laboratório demonstraram que a ativação da enzima, induzida por glicose, está de alguma maneira ligada ao metabolismo de cálcio. No entanto, a identidade da(s) proteína quinase(s) que leva à ativação da enzima ainda não foi identificada. Neste trabalho, nós mostramos os resultados de uma triagem com as cepas de levedura que apresentam deleções únicas em genes que codificam para proteínas quinases existentes em Saccharomyces cerevisiae. Para isso, foi avaliada a variação do pH extracelular durante o crescimento celular, com adição de glicose, de leveduras apresentando deleções únicas em genes que codificam para proteínas quinases conhecidas. As células foram cultivadas em placas de 96 poços em YPD 2%, e cada cultura foi avaliada com o indicador ácido-base púrpura de bromocresol. Nossos resultados demonstraram que das 95 amostras analisadas, 53 foram incapazes de promover a acidificação durante o crescimento celular. Quando a ativação induzida por glicose foi medida por meio da determinação da acidificação extracelular, apenas 20 mutantes apresentaram uma clara redução na taxa de acidificação, quando comparados à linhagem selvagem. Para eliminar as quinases que poderiam estar indiretamente envolvidas na regulação da ATPase, a sinalização de cálcio foi medida e 14 mutantes apresentaram níveis de cálcio normais durante a sinalização induzida por glicose. Posteriormente, nós determinamos as propriedades cinéticas da enzima, em membranas plasmáticas purificadas, de mutantes com deleção em genes que codificam para 7 das 14 proteínas selecionadas como potenciais candidatas ao mecanismo de fosforilação da H+-ATPase, incluindo a cepa selvagem correspondente. No entanto, essa abordagem não permitiu esclarecer completamente a(s) identidade(s) da(s) proteína(s) quinase(s) que leva(m) à ativação da H+-ATPase de membrana plasmática de Saccharomyces cerevisiae.
metadata.dc.description.abstracten: The Saccharomyces cerevisiae plasma membrane H+-ATPase is a pumping proton that plays an important role in the physiology of this microorganism since activated is able to create an electrochemical gradient essential for nutrient uptake. The presence of glucose triggers post-translational modifications that increase H+-ATPase activity. Studies performed in our laboratory demonstrated that the induced activation of this enzyme by glucose is, in some way, related to calcium metabolism. However, the identity of protein kinase (or protein kinases) that leads the H+-ATPase activation has not been identified yet. In this work, we show the results of a screening with the yeasts strains with single deletions in genes encoding for protein kinases described to exist in Saccharomyces cerevisiae. Therefore, we evaluated the extracellular pH variation during cell growth, with the addition of glucose in yeast with deletions unique in genes to known protein kinases. The cells were grown in 96-well plates in YPD 2% and each culture was assessed with the acid-base indicator bromocresol purple. Our results showed that of 95 samples analyzed, 53 were unable to promote acidification during cell growth. When the induced activation by glucose was measured by determining the extracellular acidification, only 20 mutants showed a clear reduction in the rate of acidification compared to the wild type. To eliminate the kinases that could be indirectly involved in the regulation of H+-ATPase, calcium signaling was measured and 14 mutants showed normal levels of calcium during glucose-induced signaling. Subsequently, we determined the enzyme kinetic properties in purified plasma membranes of mutants with deletions in genes coding for 7 of the 14 proteins selected as potential candidates for the H+-ATPase phosphorylation mechanism, including the corresponding wild strain. However, this approach does not clarified completely the identify of protein kinase (s) that takes (m) to the activation of H+-ATPase of the membrane of Saccharomyces cerevisiae.
URI: http://www.repositorio.ufop.br/handle/123456789/2689
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