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Title: Isolamento, propriedades bioquímicas e estudos biológicos da lectina de sementes da Macrotyloma axillare (E. Meyer).
Authors: Santana, Marcos Aurélio de
metadata.dc.contributor.advisor: Andrade, Milton Hércules Guerra de
Keywords: Lectinas
Purificação - proteínas
Bioquímica
Issue Date: 2004
Publisher: Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto.
Citation: SANTANA, M. A. Isolamento, propriedades bioquímicas e estudos biológicos da lectina de sementes da Macrotyloma axillare (E. Meyer). 2004. 100 f. Dissertação (Mestrado em Ciências Biológicas) - Universidade Federal de Ouro Preto, Ouro Preto, 2004.
Abstract: Duas frações de uma lectina específica para 2-N-acetil-galactosamina foram isoladas de sementes da Macrotyloma axillare (LMA) através de uma metodologia alternativa a cromatografia de afinidade. As frações ativas foram purificadas por precipitação térmica do extrato bruto a 90°C por 30 min; precipitação com etanol a frio na concentração de 20-60%, seguido de cromatografia de troca iônica em pH 8,3 procedendo-se a eluição com gradientes crescentes isocráticos de NaCl. As frações de eluição 0,2M e 0,3M de NaCl apresentaram atividade hemaglutinante sobre hemácias A1. A análise eletroforética em géis de poliacrilamida-SDS a 12% das frações revela uma banda única com massa molecular de 29 KDa. Em ensaios de estabilidade pH-dependente, foi demonstrado que a LMA 0,2M é completamente estável no intervalo de pH de 6,0-8,0 e a LMA 0,3M, de 5,0-9,0. Através de determinações de massa molecular por cromatografia de exclusão molecular em pH diferentes, demonstrou-se que ambas as isoformas 0,2M e 0,3M da LMA tendem a se comportar como tetrâmeras em pH alcalino (8,3) e como dímeras em pH ácido e neutro (5,0 e 7,0). Ensaios de atividade sobre hemácias nativas dos grupos sanguíneos A1, A2, B e O confirmaram a especificidade de ambas as frações por hemácias A1, no entanto o ensaio com hemácias tripsinizadas demonstrou que a LMA 0,3M perde sua especificidade, aglutinando hemácias de todos os grupos; a LMA 0,2M permaneceu específica para o grupo A (mas sem distinção qualitativa de A1 e A2. Estudos de aglutinação de cepas de Escherichia coli com a LMA 0,2M mostraram cerca de 8% de positividade numa amostra de 103 cepas testadas, com títulos aglutinantes diferenciados, indicando que a 2-N-acetilgalactosamina mostra-se pouco distribuída nas cepas testadas. Através de estudos de distribuição de 99mTc-LMA 0,2M em camundongos Swiss em diferentes tempos, pôdese observar que a 99mTc-LMA 0,2M se concentra predominantemente nos rins e na urina após 180 minutos, indicando uma provável ligação da lectina marcada nos rins e transporte de lectina intacta para urina desses animais. A metodologia proposta foi eficiente para o isolamento das duas frações ativas (0,2 e 0,3M) da lectina das sementes da Macrotyloma axillare.
metadata.dc.description.abstracten: Two fractions of a 2-N-acetilgalactosamine (2-NacGal) specific lectin was isolated of Macrotyloma axillare seeds (LMA) using an alternative methodology to affinity chromatography. The active fractions was purified by thermal precipitation of the gross extract at 90°C for 30 minutes; precipitation with 20-60% cold ethanol, followed by ion exchange chromatography pH 8,3 and elution in step-wise NaCl gradients. The 0,2M and 0,3M NaCl elution intervals presented hemagglutination activity on red blood cells A1. A @29KDa single band was revealed in the 12% SDS-page electrophoresis analysis. The stability assays in different pH was demonstrated that 0,2M LMA is completely stable in 6,0-8,0 and the 0,3M LMA, of 5,0-9,0. The tendency to form tetramers was demonstrated in both isoforms 0,2M LMA and 0,3M LMA in alkaline pH (8,3) and dimmer in acid and neutral pH (5,0 and 7,0), it was verified in exclusion chromatography of molecular mass. The especificificity of both fractions was demonstrated for red blood cells A1, using activity assays in native red blood cells (A1, A2, B and O blood group). However, the 0,3M LMA had hemagglutination activity at all groups of the trypsinizated red blood cells, losing its specificity in contrast with the 0,2M LMA that stayed A group specific, but without qualitative distinction of A1 and A2. The 0,2M LMA presented positive agglutination in @8% of one sample with 103 Escherichia coli strains in agglutination assays. Differentiated agglutinative titles were observed, indicating that 2-NacGal is not very distributed in the tested strains. In biodistribution assays, the radioactivity was detected on kidneys and in the urine after 180 minutes after the 0,2M 99mTc-LMA injections in Swiss mice, indicating a probable specific binding of the in the kidneys and intact 0,2M 99mTc-LMA transport to the mice’s urine. The proposed alternative method purified the two active fractions (0,2 and 0,3M) from the seeds of the Macrotyloma axillare.
URI: http://www.repositorio.ufop.br/handle/123456789/2661
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