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Title: Formas reduzidas de inibidor Bowman-Birk, biodisponibilidade em íleo isolado de camundongo e atividade no proteassoma.
Authors: Amorin, Larissa Lovatto
metadata.dc.contributor.advisor: Andrade, Milton Hércules Guerra de
Keywords: Inibidores químicos
Câncer
Peptídeos ativos
Bioquímica
Issue Date: 2009
Publisher: Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto.
Citation: AMORIN, L. L. Formas reduzidas de inibidor Bowman-Birk, biodisponibilidade em íleo isolado de camundongo e atividade no proteassoma. 2009. 78 f. Dissertação (Mestrado em Ciências Biológicas) - Universidade Federal de Ouro Preto, Ouro Preto, 2009.
Abstract: Os inibidores do tipo Bowman-Birk (BBI) são moléculas protéicas contendo dois domínios inibitórios distintos para enzimas semelhantes à tripsina e quimotripsina. O interesse por essa classe de inibidores decorre de estudos que mostram que o BBI possui efeito protetor no câncer induzido quimicamente e em leucoplasias humanas. Estudos prévios do nosso laboratório mostraram que o inibidor obtido da semente de Macrotyloma axillare (BBIM) apresentou uma distribuição muito limitada ao interior dos vasos sanguíneos, com pequena distribuição para os tecidos. As propriedades farmacocinéticas do BBIM, como distribuição e absorção, podem ser melhoradas com a redução do tamanho deste inibidor, o que seria vantajoso do ponto de vista terapêutico. Embora os mecanismos de proteção do BBI contra o câncer permaneçam por serem elucidados, descobertas recentes indicam que o proteassoma é um importante alvo intracelular desse inibidor. Desta forma, este trabalho tem como objetivo a obtenção de formas menores do BBI: peptídeos sintéticos correspondentes aos domínios inibitórios da tripsina e quimotripsina e o BBI natural da semente de M. axillare, fragmentado. Os peptídeos sintéticos SCTKSIPPQCY e SCTFSLPPQCYGGGGG com atividades antitripsina e antiquimotripsina, respectivamente, foram sintetizados em fase sólida e identificados por LCMS-IT-TOF. Os fragmentos do inibidor da semente de M. axillare foram obtidos a partir da hidrólise com ácido fórmico a 2% em microondas por 30 min a 800 W. O estudo da absorção intestinal foi realizado em segmento de íleo isolado de camundongo pela medida da atividade inibitória que transpõe a luz intestinal. Os resultados mostraram que os peptídeos sintéticos, possivelmente, foram em grande parte degradados com perda da atividade, atingindo biodisponibilidade de apenas 5%. Por outro lado, enquanto o inibidor intacto apresentou 40% de absorção, os fragmentos atingiram valores de absorção próximos a 100 %. As formas nativas e menores dos inibidores foram também testadas em preparações de proteassoma de íleo de camundongo. Os resultados para a atividade quimotripsina-símile do proteassoma mostraram que todas as preparações do BBI inibiram essa atividade, com exceção da cabeça antitripsina do BBIM fragmentado. Em contraste, a atividade caspase-símile foi ativada pela cabeça antitripsina do BBIM fragmentado e pelo peptídeo sintético antiquimotripsina. Não foi encontrada diferença estatística para alterações na atividadetripsina-símile do proteassoma ao se comparar as diferentes preparações de BBI. Concluímos com esse trabalho que os peptídeos sintéticos não representam uma boa alternativa para o aumento de biodisponibilidade, tendo em vista a instabilidade dos mesmos. Por outro lado, os fragmentos obtidos por hidrólise ácida do BBI mostraram biodisponibilidade 2.5 vezes maior do que aquela observada para o inibidor intacto. Finalmente, o perfil de atividade sobre o proteassoma mostrou um comportamento das formas reduzidas semelhante à molécula nativa, especialmente para a atividade quimotripsina-símile, sugerindo que essas preparações possam ter as mesmas propriedades antitumorais que a molécula íntegra, mas apresentando vantagens farmacocinéticas. Estudos posteriores visando determinar as atividades antitumorais dessas preparações e sobre a atividade endógena do proteassoma, auxiliarão na compreensão de mecanismos relacionados ao desenvolvimento do câncer.
metadata.dc.description.abstracten: Bowman-Birk Inhibitors (BBI) are protein molecules exhibiting two distinct inhibitory domains for proteases similar to trypsin and chymotrypsin. The interest for this class of inhibitors arose from studies showing a protective effect of BBI against chemicallyinduced cancers and human leukoplasias. Previous studies from our laboratory revealed that the inhibitor obtained from the seeds of Macrotyloma axillare (BBIM) displayed a quite limited distribution to the bloodstream and therefore with limited access to tissues. The pharmacokinetic properties of BBIM such as distribution and absorption can be improved by reducing the size of the inhibitor, which offers clear advantages in respect to its therapeutic applications. Although the mechanisms behind its anticancer properties are yet to be elucidated, recent findings indicate the proteasome as an important intracellular target of BBI. The present study aimed to obtain the following BBI derivatives of reduced size: synthetic peptides, corresponding to the inhibitory domains of trypsin and chymotrypsin, and fragmented versions of the native BBIM. The synthetic peptides SCTKSIPPQCY and SCTFSLPPQCYGGGGG, exhibiting antitrypsin and anti-chymotrypsin acitivities respectively, were produced by the solid phase method and identified by LCMS-IT-TOF. The fragments derived from BBIM isolated from seeds were obtained by hydrolysis using 2% formic acid in a microwave for 30 min at 800W. Absorption of BBIM and its derivatives was evaluated by measuring the inhibitory activity that traverse the intestinal lumen using a segment of ileum isolated from mice. Our results indicated that the bioavailability for synthetic peptides was only 5%, possibly as a result of loss of activity due to degradation. In contrast, while the native BBIM reached 40% absorption, its fragments, obtained from acid hydrolysis, reached up to 100% bioavailability. Native and BBI derivatives were also tested for their ability to inhibit proteasome acitivities contained in a soluble preparation from ileum. With the exception of the anti-trypsin head, obtained from fragmented BBIM, all investigated derivatives inhibited the proteasome chymotrypsin-like activity. Contrarily, it was observed activation of the caspase-like activity by the anti-trypsin head and by the anti-chymotrypsin synthetic peptide. No statistically significant difference was observed for the trypsin-like activity in the presence of all investigated inhibitors. Our results allowed us to conclude that synthetic peptides do not represent a good alternative to increase bioavailability of BBI derivatives, possibly due to their high instability. However, BBI fragments derived from acid hydrolysis revealed demonstrable pharmacokinetic advantages over both, the native molecule and synthetic peptides. At last, from our proteasome peptidase assays we concluded that the reduced forms of BBI do not compromise their ability to inhibit this complex, especially concerning its chymotrypsin-like activity. In light of this result, we hypothesize maintenance of antitumor properties of BBI derivatives compared to the native molecule. Further investigations will evaluate the anti-tumor activities of our inhibitors, using appropriate models, which may ultimately help in the elucidation of the mechanisms linked to cancer development.
URI: http://www.repositorio.ufop.br/handle/123456789/2654
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