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Title: Tratamento com benzonidazol em camundongos infectados com misturas de populações do Trypanosoma cruzi pertencentes aos genótipos principais.
Authors: Martins, Helen Rodrigues
metadata.dc.contributor.advisor: Lana, Marta de
Keywords: Benzonidazol
Camundongo como animal de laboratório
Trypanosoma cruzi - infecção
Issue Date: 2008
Publisher: Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto.
Citation: MARTINS, H. R. Tratamento com benzonidazol em camundongos infectados com misturas de populações do Trypanosoma cruzi pertencentes aos genótipos principais. 2008. 58 f. Tese (Doutorado em Ciências Biológicas) - Universidade Federal de Ouro Preto, Ouro Preto, 2008.
Abstract: O objetivo desse trabalho foi avaliar o impacto de infecções mistas por clones de Trypanosoma cruzi pertencentes aos quatro genótipos principais na eficácia terapêutica do Benzonidazol (BZ) em camundongos BALB/c. Para esta proposta, foram empregados dois clones do T. cruzi de cada genótipo com diferentes níveis de virulência e de susceptibilidade ao BZ, que foram combinados aos pares totalizando 24 misturas distintas avaliadas comparativamente às respectivas monoinfecções. O tratamento com BZ reduziu os níveis de parasitemia além de outros parâmetros relacionados na maioria das infecções mistas, exceto nas da combinação dos genótipos 39+32. As taxas de mortalidade dos animais tratados (IT) e seus controles (INT) não diferiram significativamente entre as monoinfecções e as infecções mistas. A cura após tratamento foi definida empregando o critério de cura clássico, proposto por Krettli & Brener (1982) por meio de métodos parasitológicos (exame de sangue a fresco-ESF, hemocultura-Hc e PCR no sangue) e sorológicos (ELISA e pesquisa de anticorpos antitripomastigotas vivos-AATV) e, permitiu classificar os animais em tratados não curados (TNC=72,2%), tratados curados (TC=19,1) e dissociados (DIS=8,7%). Em geral, o ESF apresentou baixa positividade para a detecção da falha terapêutica (18,1%). A Hc apresentou sensibilidade satisfatória para a maioria das infecções, exceto nos animais infectados com o genótipo 39 e com a combinação 39+32; enquanto a PCR foi o método parasitológico mais sensível, a despeito da diversidade genética do T. cruzi. Os dados demonstraram que a ELISA não deve ser utilizada em amostras coletadas antes de três meses após tratamento, uma vez que pode apresentar resultados falsos negativos. A AATV foi mais eficiente na categorização dos animais em relação à resposta terapêutica e na definição precoce de cura. Os dados do presente estudo elegem a AATV e a PCR em sangue como as técnicas mais adequadas para a definição precoce de cura após tratamento da fase aguda da infecção pelo T. cruzi no modelo murino. Um importante achado deste estudo foi a observação de resultados positivos da PCR em tecidos de animais considerados curados pelo critério clássico, sugerindo infecção residual. Uma importante questão levantada por esses resultados é se a cura parasitológica de fato existe. A avaliação dos perfis de susceptibilidade ao BZ das infecções mistas foi realizada pela comparação entre os índices de cura observado e o esperado e, revelou mudança em direção ao padrão de menor susceptibilidade ao BZ nas combinações 19+39 e 19+32. Entretanto, quando os resultados foram analisados em nível dos clones do T. cruzi, foram observadas mudanças em nove das 24 misturas tendo sido detectados tanto aumento como diminuição na susceptibilidade ao fármaco. A caracterização molecular da amostra Cuica cl1, até então considerada um clone, demonstrou ser constituída de fato por duas populações geneticamente distintas cuja dinâmica populacional pode mudar dependendo da manutenção laboratorial. Entretanto, essas duas populações não apresentaram diferenças no perfil de susceptibilidade ao BZ. Em geral, a PCR de microssatélites apresentou boa correlação com a análise de isoenzimas na identificação dos clones presentes nas amostras isoladas de animais TNC e INT e confirmou a relação filogenética previamente determinada entre os clones por meio das análises de isoenzimas e RAPD. Apesar da análise de microssatélites apresentar baixa eficiência na identificação dos clones diretamente no sangue e nos tecidos de animais INT e TNC, os resultados obtidos dessas amostras biológicas foram similares aos obtidos para clones caracterizados após o isolamento pela Hc. Foram detectadas misturas em 7,7% dos isolados provenientes de animais INT e TNC obtidos por Hc. Em algumas misturas, resultados interessantes foram detectados revelando a presença do clone mais susceptível nas monoinfecções. Considerando a estrutura clonal do T. cruzi, um resultado inesperado foi a identificação de 15,5% dos isolados apresentando subpopulações do parasito com alelos de microssatélites distintos comparados aos clones originais. Esses achados sugerem que em alguns casos o tratamento com Benzonidazol pode resultar em um desequilíbrio da relação parasito-hospedeiro e levar ao estabelecimento de um curso da infecção distinto. Em conjunto, esses achados sugerem que infecções mistas podem apresentar um importante impacto na eficácia terapêutica. Estudos futuros são necessários para o melhor entendimento dos mecanismos envolvidos nas mudanças genéticas e no perfil de susceptibilidade ao Benzonidazol observado nas infecções mistas e o real benefício do tratamento para o hospedeiro.
metadata.dc.description.abstracten: The aim of this work was to investigate the impact of mixed infections of Balb/c mice with isolates of four T. cruzi genotypes on the Benznidazole (BZ) therapeutic efficacy. For this purpose two T. cruzi clones from each major genotype, with distinct virulence and BZ-susceptibility, were combined into twenty-four mixed infections and comparatively studied with the respective single infections. BZ-treatment reduced significantly the parasitemia and other related parameters in most mixed infections, except for 39+32. The BZ-treatment of single and mixed infections did not promoted significant changes in mortality, although decrease was observed in five mixtures. The cure assessed by classical criterion (Krettli & Brener, 1982) were performed by parasitological (Fresh Blood examination-FBE, Haemoculture-Hc and Blood-PCR) and serological methods (ELISA and detection of anti-trypomastigotes antibodies by flow-cytometry-ALTA) and allowed to classify the treated animals as treated not cured (TNC=72,2%), treated cured or dissociated (TC= 19,1%, DIS=8,7%). In general, the FBE displayed lower sensibility to detect therapeutic failure (18.1%). The Hc presented satisfactory sensibility to detect infection and therapeutic failure (89,4% and 79,3%), except for the genotype 39 and the combinations 39+32, whereas Blood-PCR was the most sensitive method to detect both (95,3% and 96,9%), independently to the T. cruzi genetic diversity. Our data demonstrated that ELISA should not be used before three months after treatment due to the risk of negative false results. NCS-FC-ALTA was more efficient than ELISA to define the early BZ-therapeutic response. Our findings elect NCS-FC-ALTA and Blood-PCR as the most suitable methods to early detect therapeutic failure in murine T. cruzi. A major finding of this study was the observation of positive Tissue-PCR in animals considered cured by the classical criterion, may indicating residual infection. These results may raise the question whether in fact parasitological cure of T. cruzi infections exist. Another relevant issue of this study was the assessment of BZ-susceptibility of mixed infections by comparing the observed and expected results (theoretical resultant of BZ-susceptibility from single-infection combinations), demonstrating a shift toward a lower BZ-susceptibility pattern at major genotypes level for the genotype combinations 19+39 and 19+32. However, at T. cruzi clone level, our data demonstrated that indeed 9 out of the 24 mixed infection tested shifted their expected profile toward lower or higher BZ-susceptibility. The molecular characterization of Cuica cl1 sample, previously being considered a T. cruzi clone, showed to be in fact composed of two genetically distinct subpopulations that presented changes in population dynamics depending on laboratorial condition of maintenance. However, difference in BZ-susceptibility was not observed between those populations. Generally, analysis of microsatellite patterns of clones isolated from not treated (INT) or treated not cured animals (TNC) showed good correlation with isoenzyme profiles confirming the phylogenetic relationship among the clones of T. cruzi major genotypes previously analyzed by isoenzyme and RAPD (Tibayrenc et al., 1993). Despite microsatellite analysis presented low efficiency in the identification of clones directly from blood and tissues samples from INT or TNC, the results obtained from these biological samples were very similar to those obtained for clones characterized after isolation by Hc. Mixtures were detected in 7.7% of the isolates obtained from INT and TNC animals by Hc. Interestingly, our data demonstrated that in some mixed infection the T. cruzi clone isolated after BZ treatment was indeed BZ-susceptible in single-infections. Considering the clonal structure of T. cruzi an unexpected result was the identification of 15,5% of isolates from TNC with parasite subpopulations distinct microsatellite alleles when compared to the original clones used in the inoculation. These findings suggest that in some cases BZ-treatment can result in unbalanced parasite-host relationship and establish a distinct course of the infection as well as unexpected BZ susceptibility. Taken together, the data presented in this study suggest that mixed infections may have important impact on BZ-therapy efficacy. Further studies are still needed to better understand the mechanisms underlying the changes in the parasite’s genetic and drug susceptibility in mixed infections and the real benefits of the etiological treatment for the host.
URI: http://www.repositorio.ufop.br/handle/123456789/2612
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