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Title: Análise bioinformática de transcritos da glândula de veneno da aranha – marrom Loxosceles intermedia e construção de baculovírus recombinantes como vetores de toxinas inseticidas.
Authors: Castro, Cibele Soares de
metadata.dc.contributor.advisor: Castro, Ieso de Miranda
Keywords: Biologia molecular
Baculovirus anticarsia
Aranha
Aracnídio venenoso
Inseticidas
Issue Date: 2005
Publisher: Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto.
Citation: CASTRO, C. S. de. Análise bioinformática de transcritos da glândula de veneno da aranha – marrom Loxosceles intermedia e construção de baculovírus recombinantes como vetores de toxinas inseticidas. 2005. 182 f. Dissertação (Mestrado em Ciências Biológicas) - Universidade Federal de Ouro Preto, Ouro Preto, 2005.
Abstract: Neste trabalho, objetivando a caracterização molecular de transcritos da glândula de veneno da aranha-marrom Loxosceles intermedia para a ampliação do banco de dados de toxinas, 268 seqüências foram agrupadas em 136 singlets e 33 consensos. Estas seqüências foram submetidas à anotação gênica para que fossem identificadas por meio de buscas de similaridade contra diferentes bancos de dados. Em seguida, foram classificadas em categorias funcionais, analisadas quanto a sua função biológica e, quando possível, modeladas por homologia para que verificássemos sua provável estrutura tridimensional. Além disso, a fim de produzir bioinseticidas de alta eficiência e especificidade, trabalhamos com toxinas de atividade letal para insetos de importância agrícola. Recentemente, a partir da purificação do veneno bruto de L. intermedia e da construção de uma biblioteca de cDNA das glândulas de veneno desta aranha, nosso grupo caracterizou toxinas com forte ação inseticida em larvas de Spodoptera frugiperda, a lagarta-do-cartucho do milho. Devido às dificuldades para se obter do veneno bruto as toxinas identificadas por biologia molecular, o uso de sistemas de expressão heterólogos torna-se necessário tanto para o estudo dos genes isolados dessas toxinas quanto para a sua obtenção em grandes quantidades. Um dos sistemas heterólogos de controle a pragas mais estudados em nível nacional e internacional é aquele que utiliza baculovírus no combate a diversas pragas agrícolas. O sistema baculovírus supera em vários aspectos os sistemas tradicionais de inseticidas químicos, sendo considerado por diversos autores como seguro ao meio ambiente e ao homem e, também, apresentando potencialmente um custo final por hectare menor do que o dos inseticidas químicos. Assim, realizamos - através da subclonagem em vetores de transferência do sistema de expressão baculovírus - a inserção dos genes das toxinas inseticidas LiTx1, LiTx2 e LiD1 (previamente identificadas a partir da glândula de veneno de L. intermedia) ao genoma do baculovírus AcMNPV. O sucesso da construção dos vírus recombinantes foi verificado após infecção de células de inseto e também por PCR. A expressão das toxinas LiTx1, LiTx2 e LiD1 foi verificada por RT-PCR, SDS-PAGE e Western Blotting. Bioensaios com os vírus recombinantes LiTx1 e LiTx2 em larvas de S. frugiperda demonstraram sua eficácia inseticida, com diminuição do tempo de vida desta lagarta, quando comparada aos vírus selvagens. Acreditamos que os baculovírus recombinantes aqui gerados poderão permitir a expressão em larga escala das toxinas LiTx1, LiTx2 e LiD1 de L. intermedia. Isso possibilitará a realização de estudos de caracterização dessas toxinas inseticidas quanto aos seus mecanismos de ação e permitirá também sua utilização como ferramentas na pesquisa básica para estudos de canais iônicos e outros processos fisiológicos.
metadata.dc.description.abstracten: In order to get an overview of all Loxosceles intermedia venom gland transcripts, we performed a clustering analysis of 268 cDNA sequences available in our laboratory. The 136 singlets and 33 consensus sequences generated after alignment, allowed the identification by database searches of several distinct genes/proteins in the gland. We analyzed these sequences, classified them in functional categories (biological function) and, whenever possible, predicted their 3D structure by homology. Moreover, aiming the production of highly efficient bioinsecticides, our group has worked with insecticidal toxins. Recently, we located and characterized, by chromatography of L. intermedia crude venom and screening of its venom gland cDNA library, lethal toxins to Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae): a plague which attacks the Brazilian corn culture since harvesting to storage. Due to practical limitations to get from the crude venom a high rate of previously identified neurotoxins, the use of expression systems to study heterologous genes becomes necessary. Baculovirus is one of the most studied heterologous systems used worldwide as a resource for combating pests. They are powerful, versatile and provide advantages concerning finance, ecology and human health. In this manner, we subcloned genes of the insecticidal toxins LiTx1, LiTx2 and LiD1 (previously identified from L. intermedia venom gland) in baculovirus expression vectors. The construction’s success of the recombinant virus was verified after insects cells infection and also by PCR. The expression of LiTx1, LiTx2 and LiD1 toxins was verified by RT-PCR, SDSPAGE and Western Blotting. Bioassays with the recombinant virus LiTx1 and LiTx2 in S. frugiperda larvae showed their insecticidal efficacy, with life-time reduction of this plague when compared to the wild virus. We believe recombinant baculovirus herein generated will allow a large scale expression of L. intermedia toxins LiTx1, LiTx2 and LiD1. This will conduce to characterization studies of the action mechanisms of these toxins and also will permit their use as tools to basic researches in ionic channels and physiologic processes.
URI: http://www.repositorio.ufop.br/handle/123456789/2602
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