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Title: Clonagem e expressão da sequência codificante para o peptídeo maduro LTx4 da aranha Lasiodora sp em sistema pET21b.
Authors: Pimentel, Filippe Gadioli
metadata.dc.contributor.advisor: Castro, Ieso de Miranda
Keywords: Biologia molecular
Clonagem
Genética - expressão
Aranha - veneno
Issue Date: 2010
Publisher: Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto.
Citation: Pimentel, F. G. Clonagem e expressão da sequência codificante para o peptídeo maduro LTx4 da aranha Lasiodora sp em sistema pET21b . 2010. 93 f. Dissertação (Mestrado em Ciências Biológicas) - Universidade Federal de Ouro Preto, Ouro Preto, 2010.
Abstract: Peptídeos neurotóxicos encontrados em venenos animais têm despertado um grande interesse de pesquisadores. A possibilidade de utilizá-los como ferramentas moleculares para estudos em canais iônicos, além do uso como bioinseticidas e/ou como biofármacos, tem impulsionado as pesquisas nessa área. Experimentos com o veneno bruto da aranha caranguejeira Lasiodora sp mostraram que o mesmo atua em canais iônicos de pequenos vertebrados e de invertebrados. Recentemente, construímos uma biblioteca de cDNA a partir dos mRNAs presentes na glândula de veneno dessa aranha. A varredura desta biblioteca, usando a técnica de ELISA, e o sequenciamento de DNA, permitiram a identificação de cinco toxinas presentes no veneno, nomeadas LTx1, LTx2, LTx3, LTx4 e LTx5. Experimentos realizados com a toxina recombinante LTx2, em células musculares BC3H1, mostraram que esse peptídeo bloqueia canais de cálcio tipo-L e inibe a recarga de Ca2+ dos estoques intracelulares. A estrutura primária do peptídeo LTx2 é muito similar a dos peptídeos LTx1 e LTx3, portanto, espera-se que essas toxinas possuam mescanismos de ação semelhantes. Por outro lado, a sequência de aminoácidos da LTx4 e da LTx5 são bem diferentes, tanto quando comparadas com a LTx1, LTx2 e LTx3, quanto entre si, o que leva a acreditar que elas possam atuar em diferentes canais e/ou ter diferentes mecanismos de ação. Neste trabalho, a sequência codificante para o peptídeo maduro LTx4 foi subclonada no vetor de expressão pET21b (Novagen). A estratégia foi inserir o gene de interesse sob o controle do promotor T7 e obter um produto expresso em fusão com uma cauda de seis histidinas. A confirmação da clonagem foi realizada através de PCR, digestão do DNA plasmidial com endonucleases de restrição e, finalmente, seqüenciamento dos DNAs extraídos dos clones positivos. A indução da expressão do peptídeo LTx4 foi realizada com a adição de 1mM de IPTG ao meio de cultura. Nos ensaios de imunodetecção utilizamos o anticorpo monclonal anti His-Tag. O peptídeo recombinante foi identificado tanto em experimentos de Western Blot como em experimentos de Dot Blot. O peptídeo recombinante foi expresso exclusivamente na forma de corpos de inclusão e em maiores quantidades após três a quatro horas de indução. O perfil protéico foi analisado em géis de poliacrilamida (Tricina-SDS). Experimentos de purificação do peptídeo encontramse em andamento.
metadata.dc.description.abstracten: Peptide neurotoxins found in animal venoms have attracted great interest of researchers. The possibility of using them as tools for molecular studies of ion channels in addition to use as biopesticides and/or as biopharmaceuticals has boosted research in this area. Experiments with the venom of the spider Lasiodora sp showed that it acts on ion channels of small vertebrates and invertebrates. Recently, we constructed a cDNA library from mRNAs present in the venom gland of this spider. The screen of this library, using ELISA and DNA sequencing, allowed the identification of five toxins in the venom, named LTx1, LTx2, LTx3, LTx4 and LTx5. Experiments conducted with recombinant toxin LTx2 in muscle cells BC3H1 showed that this peptide blocks L-type calcium channels and inhibits Ca+2 recharge from intracellular stores. The primary structure of the peptide LTx2 is very similar to the peptides LTx1 and LTx3, and consequently it is expected that these toxins have similar action mechanisms. On the other hand, the amino acids sequences of LTx4 and LTx5 are quite different, both when compared with LTx1, LTx2 LTx3 and as between themselves, which leads to believe that they can act on different channels and/or have different action mechanisms. In this work, the coding sequence for the mature peptide LTx4 was subcloned at the expression vector pET21b (Novagen). The strategy used was to insert the gene of interest under the control of T7 promoter and obtain the expression product in fusion with a six histidine tag. The cloning confirmation was performed by PCR, plasmid DNA digestion with restriction enzymes, and finally, sequencing of DNAs extracted from the positive clones. The induction of LTx4 peptide expression was performed by addition of 1mM IPTG to the culture medium. At the immunodetection assay, we used monoclonal antibody anti His-tag. The recombinant peptide was identified by both Western Blot and Dot Blot experiments. The recombinant peptide was expressed exclusively as inclusion bodies and in larger amounts after three to four hours of induction. The protein profile was analyzed on polyacrylamide gel electrophoresis (Tricine-SDS). Peptide purification experiments are in course.
URI: http://www.repositorio.ufop.br/handle/123456789/2569
Appears in Collections:PPCBIOL - Mestrado (Dissertações)

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