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Title: E-NTPDase-2 de Leishmania amazonensis é importante na adesão do parasito ao macrófago e participa da modulação da resposta inflamatória, de forma dependente e independente da atividade ectonucleotidás.
Authors: Gomes, Rodrigo Saar
metadata.dc.contributor.advisor: Afonso, Luís Carlos Crocco
Keywords: Leishmania brasiliensis
Citocinas
Macrófagos
Óxido nítrico
Issue Date: 2015
metadata.dc.contributor.referee: Afonso, Luís Carlos Crocco
Horta, Maria de Fátima Martins
Oliveira, Camila Indiani de
Bezerra, Frank Silva
Diniz, Lívia de Figueiredo
Citation: GOMES, Rodrigo Saar. E-NTPDase-2 de Leishmania amazonensis é importante na adesão do parasito ao macrófago e participa da modulação da resposta inflamatória, de forma dependente e independente da atividade ectonucleotidás. 2015. 165 f. Tese (Doutorado em Ciências Biológicas) - Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Universidade Federal de Ouro Preto, Ouro Preto, 2015.
Abstract: As NTPDases (nucleosídeo trisfosfato difosfohidrolases) são enzimas com a habilidade de hidrolisar nucleotídeos di e trifosfatados sob estímulo de íons bivalentes (Ca2+ ou Mg2+). São encontradas em diversos tipos celulares, incluindo protozoários, como parasitos do gênero Leishmania. Dada a relação entre a expressão e a atividade de Ecto-NTPDase de L. amazonensis e a capacidade do parasito em causar lesão em camundongos, decidimos investigar os mecanismos pelos quais essa enzima participa da infecção em macrófagos, a principal célula hospedeira para Leishmania. Primeiramente investigamos o papel da expressão dessa enzima na adesão à célula hospedeira. Observamos que promastigotas metacílicas que possuem alta expressão de E-NTPDase-2 aderem mais à células J774. A inibição da expressão dessa enzima por cultivo em meio suplementado com adenina reduz a adesão e internalização dos parasitos. Demonstramos, ainda, que o bloqueio da enzima por anticorpo antiNTPDase-2 de Leishmania resulta numa redução da adesão e internalização dos parasitos. Em formas amastigotas, por outro lado, a atividade e expressão da enzima é bastante reduzida e não parece ter nenhum efeito sob a infecção dessas formas. Tendo comprovado o papel da E-NTPDase-2 na adesão e internalização de L. amazonensis na célula hospedeira, objetivamos identificar o receptor de macrófagos envolvido nesse processo. Resultados anteriores levantaram a hipótese que o CR3 estaria envolvido nessa ligação. O bloqueio desse receptor com anticorpo anti-CD11b foi capaz de reduzir drasticamente a ligação e internalização de NTPDase recombinante, como demonstrado por microscopia confocal. Decidimos ainda investigar se a presença da enzima interfere com a sobrevivência do parasito em macrófagos estimulados por IFN-e LPS. Observamos que parasitos de alta atividade e expressão de E-NTPDase-2 sobrevivem mais em células ativadas, por reduzirem a produção de NO por essas células. A inibição da atividade ectonucleotidásica dos parasitos da cepa PH8, por incubação dos parasitos com DIDS, reduz a capacidade de L. amazonensis de modular a produção de NO e sobreviver em macrófagos estimulados. Além disso, a infecção por L. amazonensis reduz a produção de citocinas inflamatórias TNF-α e IL-12. Essa modulação é revertida em parasitos tratados com DIDS. Para investigar se a adenosina é responsável pela inibição da resposta inflamatória, a infecção foi realizada na presença de antagonistas específicos dos receptores de adenosina A2A ou A2B. O bloqueio dos receptores A2B reduziu a sobrevivência do parasito no interior das células estimuladas. Isso está associado com um aumento na produção de NO, IL-12 e TNF-α. Tomados em conjunto, estes resultados mostram que a atividade de E-NTPDase-2 em L. amazonensis é importante para a geração de substrato para a produção de adenosina que, ao atuar sobre os receptores A2B, reduz a produção de IL-12 e TNF-α, citocinas que são essenciais para a produção de NO pelas células estimuladas, favorecendo a infecção. Por fim, para investigar se a enzima teria um papel direto na modulação da resposta imune, tratamos macrófagos com rNTPDase de Leishmania por 3 horas. As células foram lavadas e estimuladas por 48 horas na presença de IFN-e LPS. Observamos que mesmo na ausência de atividade ectonucleotidásica, a enzima recombinante é capaz de modular a produção de NO, IL-12 e TNF-α. A inibição da atividade por DIDS ou o bloqueio dos receptores de adenosina não impede que a rNTPDase tenha um efeito imunomodulador. Mais ainda, demonstramos que quando o CD11b das células foi bloqueado por anticorpo específico, a rNTPDase perdeu a capacidade em modular a resposta inflamatória. Em síntese, demonstramos que a E-NTPDase-2 de L. amazonensis é importante na adesão do parasito à células hospedeira pela ligação ao receptor CD11b e reduz a produção de NO e citocinas inflamatórias de maneira dependente e independente da atividade ectonucleotidásica.
metadata.dc.description.abstracten: NTPDases are enzymes with the ability to hydrolyze di and triphosphate nucleotides under stimulation of divalent ions (Ca2+ or Mg2+). They are found in many cell types, including protozoa, such as parasites of the genus Leishmania. Given the relationship between the activity and expression of E-NTPDase in L. amazonensis and the parasite's ability to cause lesions in mice, we decided to investigate the mechanisms by which this enzyme is involved in infection of macrophages, the primary host cell for Leishmania. First we investigated the role of the expression of this enzyme in the adhesion to the host cell. We observed that metacyclic promastigotes that show high expression of E-NTPDase-2 adhere more to J774 cells. Inhibition of the expression of this enzyme by cultivation in medium supplemented with adenine reduces the adhesion and internalization of parasites. We show also that the use of anti-NTPDase2 of Leishmania antibody results in a reduced adhesion and internalization of parasites. In amastigotes, however, the enzyme expression and activity is quite low and does not seem to have any effect on the infection of these forms. Having established the role of E-NTPDase-2 in adhesion and internalization of L. amazonensis to the host cell, we aim to identify the receptor involved in this process. Previous results have hypothesized that the CR3 would be involved in this connection. The receptor blockade with anti-CD11b antibody was able to dramatically reduce the binding and internalization of rNTPDase, as shown by confocal microscopy. We also decided to investigate whether the presence of the enzyme interferes with the survival of the parasite in macrophages stimulated by IFN- and LPS. Parasites with high activity and expression of E-NTPDase-2 survive longer in activated cells by reducing the NO production by these cells. Inhibition of the activity of parasites PH8 strain by incubation with DIDS reduces the ability to modulate NO production and survive in stimulated macrophages. Furthermore, infection with L. amazonensis reduces the production of inflammatory cytokines TNF-α and IL-12. This modulation is reversed in parasites treated with DIDS. To investigate whether adenosine is responsible for the inhibition of the inflammatory response, the infection was carried out in the presence of specific antagonists of A2A and A2B adenosine receptors. The A2B receptor blockade reduced the survival of the parasite inside the stimulated cells. This is associated with increased production of NO, IL-12 and TNF-α. Taken together, these results show that the ENTPDase-2 activity in L. amazonensis substrate is important for the generation of adenosine production, to act on A2B receptors reducing the production of IL-12 and TNF-α by the stimulated cells, that are essential for NO production, promoting infection. Finally, to investigate whether the enzyme would have a direct role in modulating the immune response, we treated macrophages with Leishmania rNTPDase for 3 hours. Cells were washed and stimulated for 48 hours in the presence of IFN-e LPS. We observe that even in the absence of ectonucleotidase activity, the recombinant enzyme is capable of modulating the production of NO, IL-12 and TNF-α. Inhibition of activity by DIDS or blocking of adenosine receptors does not prevent the immunomodulatory effect of rNTPDase. Furthermore, we demonstrate that when CD11b was blocked by a specific antibody, the rNTPDase lost the ability to modulate the inflammatory response. In summary, we have demonstrated that E-NTPDase-2 of L. amazonensis is important in the adhesion of the parasite to the host cells by binding to CD11b receptor and reduces the production of inflammatory cytokines and NO by a dependent and independent manner of ectonucleotidase activity.
Description: Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa de Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto.
URI: http://www.repositorio.ufop.br/handle/123456789/11956
metadata.dc.rights.license: Autorização concedida ao Repositório Institucional da UFOP pelo(a) autor(a) em 02/03/2020 com as seguintes condições: disponível sob Licença Creative Commons 4.0 que permite copiar, distribuir e transmitir o trabalho desde que sejam citados o autor e o licenciante. Não permite o uso para fins comerciais nem a adaptação.
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