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Title: Tratamento da leishmaniose visceral canina empregando duas abordagens terapêuticas distintas: quimioterapia com antimoniato de meglumina lipossomal e imunoterapia com anticorpo monoclonal bloqueador do receptor de IL-10.
Authors: Cardoso, Jamille Mirelle de Oliveira
metadata.dc.contributor.advisor: Reis, Alexandre Barbosa
Roatt, Bruno Mendes
Keywords: Leishmaniose visceral canina
Leishmaniose infantum
Cão
Issue Date: 2018
metadata.dc.contributor.referee: Reis, Alexandre Barbosa
Carvalho, Andréa Teixeira de
Andrade, Hélida Monteiro de
Bahia, Maria Terezinha
Lana, Marta de
Citation: CARDOSO, Jamille Mirelle de Oliveira. Tratamento da leishmaniose visceral canina empregando duas abordagens terapêuticas distintas: quimioterapia com antimoniato de meglumina lipossomal e imunoterapia com anticorpo monoclonal bloqueador do receptor de IL-10. 2018. 146 f. Tese (Doutorado em Ciências Biológicas) - Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Universidade Federal de Ouro Preto, Ouro Preto, 2018.
Abstract: A leishmaniose visceral (LV) é um grave problema de saúde pública, em crescente expansão em várias regiões do mundo. O cão doméstico é o principal reservatório urbano do parasito quando a doença apresenta perfil epidemiológico antropozoonótico e por esta razão, a eutanásia de cães soropositivos é empregada como medida de controle da doença. Assim, o tratamento da leishmaniose visceral canina (LVC) tem sido proposto como alternativa ao sacrifício de cães soropositivos. Entretanto, a terapêutica convencional para a LVC tem sido discutida sob vários aspectos, entre eles a real competência de cura dos animais. Dessa forma, nosso estudo buscou avaliar diferentes estratégias de tratamento para a doença empregando a quimioterapia com antimoniato de meglumina lipossomal e a imunoterapia com anticorpo monoclonal bloqueador do receptor de IL-10. Nossa estratégia experimental contou com 20 cães naturalmente infectados por L. infantum, divididos em dois grupos experimentais: um grupo de cães que recebeu a quimioterapia composta por seis doses antimoniato de meglumina em lipossomas convencionais e peguilados (6,5mg de Sb5+/kg por dose) por via endovenosa lenta a cada 96h (AMLip - n=9) e o segundo grupo que recebeu a imunoterapia com anticorpo monoclonal bloqueador do receptor de IL-10 em duas doses compostas por 2 mg de cada anticorpo (contra subunidade alfa e beta) totalizando 4 mg de anticorpo por dose, por via intramuscular (Bloq IL-10R – n=11). Os cães foram avaliados antes do tratamento (T0) e após 30 (T30), 90 (T90) e 180 (T180) dias das diferentes estratégias terapêuticas sob os aspectos hemato-bioquímicos, imunológicos, clínicos e parasitológicos. Anterior ao tratamento, as formulações lipossomais compostas por mistura de lipossomas convencionais - DSPC, CHOL e DCP e lipossomas peguilados - DSPC, COL, DCP e DSPE-PEG foram avaliadas e demonstram caraterísticas físico-químicas satisfatórias do ponto de vista farmacotécnico. Da mesma forma, foi realizado uma avaliação in vitro, da capacidade funcional do anticorpo monoclonal bloqueador do repector de IL-10, demonstrando um aumento da proliferação linfocitária antígeno específica tanto para células T CD4+ quanto para células T CD8+, uma diminuição de IL-4 produzido por células CD4+ além de um aumento na produção de TNF- por células mononucleares do sangue periférico (CMSP). Nossos principais resultados revelaram que a quimioterapia com AMLip não foi efetiva em restaurar alguns parâmetros hematológicos, ao contrário dos cães tratados com Bloq Il-10R que foram capazes de restabelecer o número de linfócitos. O quadro bioquímico, à exceção aos níveis de fosfatase alcalina, não foi reestabelecido nos dois grupos, apesar de manutenção dos parâmetros. A análise do perfil imunofenotípico sanguíneo demonstrou que cães tratados com AMLip apresentaram aumento de linfócitos T CD3+ circulantes e das subpopulações de linfócitos TCD4+ e CD8+ além de linfócitos B CD21+, células NK CD5-CD16+ e monócitos CD14+ nos tempos iniciais pós tratamento (T30 e T90). Já os cães tratados com Bloq IL-10R apresentaram aumento apenas de linfócitos TCD3+CD4+ em T30 e T90. Em relação às avaliações in vitro, ambos os tratamentos não foram capazes de induzir uma capacidade linfoproliferativa antígeno específica ao fim do acompanhamento experimental (T180), apesar do aumento da proliferação de linfócitos T CD4 em T90 após a quimioterapia com AMLip e aumento da linfoproliferação de CD4 e CD8 após imunoterapia com Bloq IL-10R em T30 e T90. De forma interessante, foi observado um aumento de linfócitos TCD4+ produtores tanto de IFN- quanto de IL-4 após estimulação com ASLi em ambos os grupos apenas em T90 e uma redução na produção de IL-10 por CMSP em T30 no grupo Bloq IL-10R. Nossos resultados demonstraram que as estratégias de tratamento empregadas não foram capazes de induzir um perfil de resistência a infecção por Leishmania ao fim do acompanhamento experimental (T180). Em relação a avaliação clínica, os animais submetidos tanto a quimioterapia com AMLip quanto à imunoterapia com Bloq IL-10R não foram capazes de alcançar uma melhora de sinais/sintomas clínicos sugestivos de LVC além de não alcançarem um aumento da massa corporal e redução de esplenomegalia ao fim dos respectivos tratamentos (T180), apesar de uma melhora nesses aspectos em T30 e T90. Somando-se a esses fatores, a quimioterapia com AMLip não foi eficaz em reduzir a carga parasitária no baço e pele após ao fim deste regime tratamento. Por outro lado, a imunoterapia com Bloq IL-10R foi eficaz em reduzir a carga parasitária no baço, apesar da resposta imune antígeno específica e a avaliação clínica não seguir o mesmo padrão. Nossos resultados sugerem que uma nova intervenção terapêutica ou manutenção das distintas terapias propostas por um tempo mais prolongado pode ser necessário para a ampliar a eficácia da ação terapêutica. Além disso, nossos resultados enfatizam a necessidade da associação entre a quimioterapia e imunoterapia (imunoquimioterapia) como uma possível poderosa ferramenta na terapêutica da LVC.
metadata.dc.description.abstracten: Visceral leishmaniasis (VL) is a serious public health issue, expanding through multiple areas of the worldwide. Domestic dog is the main urban reservoir of the parasite when disease presents an anthropozoonotic profile. Due to this fact, euthanasia of seropositive dogs is widely employed as a disease control mechanism. Thereby, treatment against canine visceral leishmaniasis (CVL) has been suggested as an alternative to sacrificing infected dogs. Morevover, conventional therapy against CVL has been discussed taking multiple variables into account, such as the real healing ability of these drugs. Therefore, our study sought to evaluate different therapeutic strategies against the disease, using chemotherapy with liposomal meglumine antimoniate and immunotherapy with monoclonal antibody anti-IL-10 receptor. Our experimental strategy included 20 naturally infected dogs with L. infantum, divided in two experimental groups: the first group was treated with chemotherapy, including six doses of meglumine antimoniate inside conventional or pegylated liposomes (6,5mg of Sb5+/kg per dose), slowly injected intravenously each 96h (AMLip - n=9) and the second group was treated with immunotherapy including two doses of monoclonal antibody anti-IL-10 receptor (2mg of antibody per dose, against α and β subunits) intramuscular (Bloq IL-10R – n=11). All dogs were evaluated before treatment (T0), 30 (T30), 90 (T90) and 180 (T180) days after treatment. This follow up included haematological, biochemical, immunological, clinical and parasitological approaches. Before treatment, liposomal formulations, including a mixture of conventional - DSPC, COL and DCP and pegylated liposomes - DSPC, COL, DCP and DSPE-PEG were tested and revealed satisfactory physicochemical characteristics. Likewise, in vitro tests were performed to attest functional ability of immunotherapy with monoclonal antibody anti-IL-10 receptor, showing an increase in CD4+ and CD8+ T lymphocytes proliferation, a diminished production of IL-4 by CD4+ lymphocytes and an increase in TNF-α production by peripheral blood mononuclear cells (PBMC). Our most prominent results revealed that chemotherapy with AMLip was not able to restore haematological parameters, unlike the dogs treated with Bloq Il-10R, which were able to reinstate lymphocyte numbers. No group was able to recover biochemical parameters to normal levels, with the exception of alkaline phosphatase. Blood immunophenotypic analysis revealed that dogs treated with AMLip presented an increase of circulating CD3+ T cells lymphocyte levels, as well as higher numbers of CD4+ and CD8+ T cells. Likewise, CD21+ B lymphocytes, CD5-CD16+ NK cells and CD14+ monocytes levels were also increased, at the initial post-treatment time points (T30 and T90). On the other hand, dogs treated with Bloq IL-10R presented only an increase of CD3+CD4+ T cells at the same time points. Regarding in vitro evaluations, no treatment was able to induce CD4+ and CD8+ antigen-specific lymphoproliferative ability after 180 days (T180), despite an increase in CD4+ lymphoproliferation at T90 in dogs submitted to chemotherapy with AMLip and an increase in CD4+ and CD8+ lymphoproliferation at T30 and T90 in dogs submitted to immunotherapy with Bloq IL-10R. Interestingly, an increase of CD4+ cells producing both IFN-γ and IL-4 was observed after stimulation with ASLi in both groups at T90. In contrast IL-10 production by PBMC was decreased at T30 in dogs treated with Bloq IL-10R. Our results demonstrated an inability of both treatment strategies to induce a resistance profile to infection at the end of experimental follow-up (T180). Regarding clinical evaluation, neither the group submitted to chemotherapy with AMLip nor the one submitted to immunotherapy with Bloq IL-10R were able to reach an improvement of clinical symptoms suggestive of CVL. Likewise, neither treatments were able to increase body mass and reduce splenomegaly at the end of therapeutic strategies (T180), despite improvements on these aspects at T30 and T90. Adding to that, chemotherapy with AMLip was not able to reduce parasite load at the spleen and skin at the end of the experiment (T180). On the other hand, immunotherapy with Bloq IL-10R was able to reduce splenic parasite load, which is inconsistent with our findings regarding clinical status and antigen-specific immune response. Our results suggest that a new therapeutic approach or an extension of these approaches for a longer period could be necessary to increase therapeutic effectiveness. Moreover, our results emphasize the need to associate chemotherapy and immunotherapy, as a powerful therapeutic tool against CVL.
Description: Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa de Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto.
URI: http://www.repositorio.ufop.br/handle/123456789/10793
metadata.dc.rights.license: Autorização concedida ao Repositório Institucional da UFOP pelo(a) autor(a) em 27/02/2018 com as seguintes condições: disponível sob Licença Creative Commons 4.0 que permite copiar, distribuir e transmitir o trabalho desde que sejam citados o autor e o licenciante. Não permite o uso para fins comerciais nem a adaptação.
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