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Title: Métodos proteômicos aplicados à análise composicional e controle de qualidade da LBSap, preparação vacinal anti Leishmaniose Visceral Canina.
Authors: Gasparini, Juliana Pereira Lage da Silveira
metadata.dc.contributor.advisor: Borges, William de Castro
Keywords: Proteômica
Leishmaniose visceral
Issue Date: 2017
metadata.dc.contributor.referee: Roatt, Bruno Mendes
Coimbra, Roney Santos
Borges, William de Castro
Citation: GASPARINI, J. P. L. da. S. Métodos proteômicos aplicados à análise composicional e controle de qualidade da LBSap, preparação vacinal anti Leishmaniose Visceral Canina. 2018. 89 f. Dissertação (Mestrado em Ciências Biológicas) - Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Universidade Federal de Ouro Preto, Ouro Preto, 2018.
Abstract: A preparação vacinal LBSap consiste de um antígeno particulado de promastigotas de Leishmania braziliensis (cepa MHOM/BR/1975/M2903), rompidas por sonicação e administradas juntamente com o adjuvante saponina. A partir de estudos de fase clínica I e II em cães, foi demonstrado o potencial imunogênico da LBSap e obtido registro de patente em 2006. Com o início dos testes em escala industrial junto à empresa Ouro Fino Agronegócios, surgiram alguns questionamentos quanto ao controle composicional dessas amostras quando submetidas a diferentes condições tais como filtração terminal do produto, possibilidade de envase do imunobiológico com saponina em mesmo vial e temperatura de estocagem. Este trabalho propõe uma metodologia capaz de avaliar o proteoma total das preparações de LBSap produzidas industrialmente para detecção de variações na composição molecular quando submetida aos diferentes tratamentos. Proteômica shotgun foi ferramenta de escolha para as análises em larga escala empregando-se a cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas (LC-MS, nanoHPLC Q-Exactive). Por meio do software PEAKS Studio e do banco de dados do proteoma de L. braziliensis realizou-se identificação e quantificação label-free obtendo-se no total 1.654 proteínas comuns a essas amostras o que representa 20% do proteoma da leishmania. Os parâmetros de quantificação permitiram a comparação das diferentes formulações e avaliação de reprodutibilidade entre réplicas. No total, 451 grupos de proteínas foram diferencialmente identificados. Diferenças marcantes de quantificação foram encontradas na amostra estocada à 37°C, com diminuição no nível de proteínas possivelmente resultante de degradação, quando comparada às amostras estocadas a 4°C. Experimentos de Western Blotting mostraram que o perfil de imunorreatividade é menor nas amostras contendo saponina e armazenadas à 37ºC, quando comparado às demais, reforçando os achados de degradação. O processo de filtração terminal do produto não afetou significativamente a composição, sendo que apenas 6 proteínas abundantes foram diferencialmente identificadas. A estratégia de proteômica shotgun apresentou-se como uma ferramenta útil para determinação da composição molecular de LBSap e deve direcionar ações para desenvolvimento do controle de qualidade dessa formulação vacinal.
metadata.dc.description.abstracten: The LBSap vaccine formulation consists of a particulate antigen of Leishmania braziliensis promastigotes (strain MHOM/BR/1975/M2903), sonicated and administered along with adjuvant saponin. From the clinical phase I and II studies in dogs, the immunogenic potential of LBSap was obtained and patent registration was obtained in 2006. Prior to scaling up LBSap production at Ouro Fino Agronecios some questions were raised concerning its compositional control when subjected to different conditions such as terminal filtration of the product, possibility of packaging of the particulate antigen and saponin in the same vial and storage temperature. This work proposes a methodology capable of evaluating the total proteome of industrially produced LBSap preparations for detecting variations in molecular composition when submitted to different treatments. Shotgun proteomics was the tool of choice for large-scale analyzes using liquid chromatography coupled to mass spectrometry (LC-MS, nanoHPLC Q-Exactive). Through the PEAKS Studio software and the protein database of L. braziliensis, a label-free identification and quantification analysis was performed, obtaining 1,654 proteins common to these samples. This represented a 20% coverage of the Leishmania proteome. The quantification parameters allowed the comparison of the different formulations and evaluation of the reproducibility between replicates. In total, 451 groups of proteins were differentially identified. Significant quantification differences were found in the sample stored at 37° C, with a decrease in protein levels possibly resulting from degradation, when compared to the samples stored at 4° C. Western Blotting experiments showed that the immunoreactivity profile is of lower intensity in the samples containing saponin and stored at 37ºC, when compared to the others, reinforcing the degradation findings. Terminal filtration of the product did not significantly affect the composition, and only 6 abundant proteins were differentially identified. The strategy of shotgun proteomics was presented as a useful tool to determine the molecular composition of LBSap and should direct actions to develop the quality control of this vaccine formulation.
Description: Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa de Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto.
URI: http://www.repositorio.ufop.br/handle/123456789/10784
metadata.dc.rights.license: Autorização concedida ao Repositório Institucional da UFOP pelo(a) autor(a) em 07/02/2018 com as seguintes condições: disponível sob Licença Creative Commons 4.0 que permite copiar, distribuir e transmitir o trabalho desde que sejam citados o autor e o licenciante. Não permite o uso para fins comerciais nem a adaptação.
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