Caracterização de marcadores moleculares para diagnóstico e discriminação das quatro variantes de Xanthomonas que infectam citros.

Abstract

A agricultura é um dos principais setores da economia brasileira com uma expressiva influência no crescimento do PIB brasileiro. Uma das commodities que mais contribui para este fato é a citricultura, uma vez que o Brasil ocupa o papel de maior produtor e exportador de citros do mundo. Entretanto, diversos fatores têm afetado a produtividade de citros, com destaque para os problemas fitossanitários que acometem essa atividade em todo país. Caracterizadas pela sua fácil disseminação, três espécies de Xanthomonas estão associadas com a geração de danos e consequentes perdas citrícolas: X. citri subsp. citri patotipo A (XccA), agente causal do Cancro Cítrico Asiático, X. fuscans subsp. aurantifolii variante B (XauB) e C (XauC) causadoras da Falsa Cancrose e da Cancrose C, respectivamente, e X. alfalfae subsp. citrumelonis (Xacm) causadora da Mancha Bacteriana dos Citros. Estes diferem quanto à virulência, patogenicidade e hospedeiros. Dessa forma, estudos que visem o desenvolvimento de tecnologias para a detecção, identificação e controle dessas diferentes espécies são de extrema importância. Assim, o objetivo desse estudo foi desenvolver um método de diagnóstico molecular a partir de sequências únicas identificadas por genômica comparativa que permitam a discriminação individual e múltipla das diferentes variantes de Xanthomonas que infectam Citrus. Para a identificação das sequências únicas, análises de ferramentas OrthoMCL, MAUVE, Primer Designing do NCBI e PCR in silico foram utilizadas para o desenho e validação inicial, considerando as diferenças nos tamanhos dos amplicons de modo a facilitar a análise visual do produto amplificado. As regiões alvo foram amplificadas por PCR e analisadas em gel de agarose 3%. Os resultados mostraram que os marcadores moleculares foram específicos aos genomas alvo in silico, in vitro e in vivo, sem qualquer amplificação cruzada nos outros genomas de referência, o que foi reiterado pelos resultados de PCR multiplex. A sensibilidade de detecção foi de até 0,02ng/μL nos testes in vitro e até 1,5 x 104 UFC mL-1 nos teste in vivo. Todos os resultados encontrados não apenas evidenciaram a possibilidade de diagnóstico por diferenciação das distintas variantes de Xanthomonas causadora de doenças em citros por meio de PCR como validaram a ferramenta computacional desenvolvida para este fim.