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Title: Avaliação de parâmetros parasitológicos e imunológicos no baço, fígado e em células derivadas de leucócitos circulantes, em cães naturalmente infectados por Leishmania infantum, assintomáticos ou sintomáticos.
Authors: Vieira, João Filipe Pereira
metadata.dc.contributor.advisor: Reis, Alexandre Barbosa
Carneiro, Cláudia Martins
Soares, Rodrigo Dian de Oliveira Aguiar
Keywords: Óxido nítrico
Macrófagos
Leishmaniose visceral
Leishmania
Issue Date: 2017
metadata.dc.contributor.referee: Reis, Alexandre Barbosa
Carvalho, Andréa Teixeira de
Andrade, Hélida Monteiro de
Lana, Marta de
Borges, William de Castro
Citation: VIEIRA, João Filipe Pereira. Avaliação de parâmetros parasitológicos e imunológicos no baço, fígado e em células derivadas de leucócitos circulantes, em cães naturalmente infectados por Leishmania infantum, assintomáticos ou sintomáticos. 2018. 149 f. Tese (Doutorado em Ciências Biológicas) - Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Universidade Federal de Ouro Preto, Ouro Preto, 2018.
Abstract: A Leishmaniose Visceral zoonótica é um problema de saúde pública global com uma expansão crescente em várias regiões do mundo. O cão, como principal reservatório doméstico do parasito, apresenta-se como um dos fatores que favorecem a expansão da doença em humanos. Dois dos principais órgãos afetados pela leishmaniose visceral canina (LVC) são o baço e o fígado, que apresentam alterações estruturais, decorrentes da infecção. A célula mais parasitada no contexto da infecção por L. infantum é o macrófago, sendo também a célula mais importante na eliminação de formas amastigotas, através da produção de óxido nítrico (NO), ou espécies reativas de oxigênio (ROS). Dessa forma, nosso estudo buscou avaliar a influência de determinadas citocinas na produção de mediadores microbicidas por macrófagos do baço, fígado e derivados de monócitos circulantes, assim como, a correlação destes fatores imunológicos, com a forma clínica, a carga parasitária e a esplenomegalia no contexto da leishmaniose visceral canina (LVC). Nossa estratégia experimental contou com 27 cães, divididos entre cães não infectados (CNI - n=7), cães infectados assintomáticos (CA - n=10) e cães infectados sintomáticos (CS - n=9). Nos cães infectados, foi avaliada a carga parasitária por qPCR e LDU (Leishman donovan units), sendo observada uma carga parasitária maior no baço e fígado do grupo CS. Foi ainda avaliada a presença e grau de esplenomegalia, por ultrassonografia, sendo verificado que cães do grupo CS, apresentam um maior grau de esplenomegalia, comparativamente a cães do grupo CNI e CA. Para avaliação da resposta imune no baço e fígado, foi realizada por citometria de fluxo uma avaliação ex vivo destes compartimentos. Os resultados demonstraram que em ambos os órgãos existe uma maior população de linfócitos T CD3+ em cães do grupo CA, comparativamente ao grupo CNI. No fígado foi constatado um menor percentual de linfócitos T CD4+ e um maior percentual de linfócitos T CD8+, no grupo CS, relativamente aos grupos CNI e CA. Ao avaliar a produção intracelular de IFN- e IL-4 nas subpopulações de linfócitos T, foi observado que linfócitos T CD4+ do baço e fígado de cães do grupo CA demonstraram uma maior capacidade de produção de IFN-, em comparação aos do grupo CNI e CS. Seguidamente, foram avaliadas por qPCR as expressões de RNAm de várias citocinas associadas com a resistência e susceptibilidade e da enzima iNOS em baço e fígado, tendo sido constatada uma maior expressão de IL-12 em ambos os órgãos de cães do grupo CA, em relação ao grupo CNI. No compartimento esplênico, foi ainda observado um aumento na expressão de iNOS no grupo CA, por comparação aos grupos CNI e CS e um aumento na expressão de IL-10 nos cães do grupo CS, em relação aos grupos CA e CNI. Ainda nos compartimentos esplênico e hepático, foi avaliada a produção de NO e ROS por macrófagos, tendo sido constatada um aumento na frequência de macrófagos produtores de NO em cães do grupo CA, por comparação aos do grupo CNI. Em relação à produção de ROS, foi observada uma maior produção em macrófagos do grupo CA, em relação ao grupo CNI, em ambos os órgãos. Foram ainda realizadas avaliações imunológicas in vitro, em sistemas de co-cultivo incluindo macrófagos derivados de monócitos circulantes após infecção com promastigotas vivos de L. infantum GFP, em cultivo com subpopulações de linfócitos T autólogos (M + CD4+; M + CD8+; M + CD4+ e CD8+). Partindo desses co-cultivos foi concluído que macrófagos do grupo CA apresentaram uma maior redução da taxa e intensidade de infecção quando em co-cultivo com linfócitos T CD4+ e/ou CD8+, além disso foi observada um maior predomínio de linfócitos T CD4+ produzindo IFN- em detrimento de células produtoras de IL-4 nos cães do grupo CA. Além disso, foi constatado qCA apresentaram um maior percentual de macrófagos produtores de NO quando em co-cultivo com linfócitos T CD4+ e linfócitos T CD4+ e CD8+, quando comparados ao grupo CS. Foi ainda, examinada a possível existência de correlações entre os parâmetros avaliados nas diferentes metodologias. Foi assim observada uma íntima correlação entre fatores, tais como, a expressão de IL-12, o percentual de linfócitos T CD4+ produtores de IFN- e o percentual de macrófagos produtores de NO que estão associados à resistência. Por outro lado, fatores tais como a expressão esplênica de IL-10, a esplenomegalia e o parasitismo, são fatores intimamente associados à susceptibilidade perante a infecção por L. infantum. Estes resultados contribuem para o entendimento da imunopatologia da LVC e permitiram identificar marcadores de resistência e susceptibilidade, num contexto clínico e no desenvolvimento de novas formas de diagnóstico e vacinas.
metadata.dc.description.abstracten: Visceral Leishmaniasis is a global health issue expanding through various regions of the world. As the main domestic reservoir of Leishmania.infantum, infected dogs present as a decisive factor in disease transmission to humans. Liver and spleen, two of the most affected organs by canine visceral leishmaniasis (CVL), often present with architectural alterations, caused by infection. The most parasitized cell by L. infantum is the macrophage, which is also key in the elimination of amastigote forms, achieved by nitric oxide (NO) and reactive oxygen species (ROS) production. Thus, this study evaluated how the expression of certain cytokines influence NO and ROS production by splenic, hepatic and monocyte derived macrophages and the correlation between these immunological factors, with clinical status, parasite load and splenomegaly in CVL. Our experimental strategy included 27 dogs, divided between non-infected (NID n=7), infected asymptomatic (AD n=10) and infected symptomatic (SD n=9). In infected dogs, parasite load was evaluated using qPCR and LDU (Leishman donovan units) and a higher parasite load was observed in the splenic and hepatic compartments of SD. Splenomegaly was also assessed using ultrasonographic methods, with SD presenting with more severe splenomegaly compared with NID and AD. Splenic and hepatic immune response was also evaluated using ex vivo techniques. Results have shown a higher percentage of CD3+ lymphocytes in AD, compared with NID in both organs. In the hepatic compartment a lower frequency of T CD4+ lymphocytes and a higher percentage of T CD8+ lymphocytes was observed in SD, compared with NID and AD. Subsequently, IFN- and IL-4 intracellular production by these subsets of T lymphocytes was evaluated and a higher frequency of T CD4+ lymphocytes producing IFN- was observed in AD, compared with NID and SD in both splenic and hepatic compartments. Furthermore, mRNA expression of cytokines associated with resistance or susceptibility to LVC and iNOS was assayed, by qPCR and it was concluded that IL-12 expression in both organs was higher in AD, compared with NID. Specifically to the splenic compartment, a higher level of iNOS was observed in AD dogs, compared with NID and SD. Additionally, SD dogs presented with higher expression. of IL-10, relative to NID and AD. Finalizing the ex vivo assessments, NO and ROS production by splenic and hepatic macrophages was evaluated. In both organs, a higher frequency of NO producing macrophages was observed in AD, compared with NID and SD. Moreover, AD macrophages from both organs presented with higher ROS production ability, compared with NID. To complement this work, in vitro immunological evaluations were also performed, using co-culture systems of L. infantum infected monocyte derived macrophages in culture with autologous T lymphocyte subsets (M + CD4+; M + CD8+; M + CD4+ and CD8+). From these co-cultures it was concluded that macrophages from AD group, presented with steeper drops in infection rate and intensity when cultured with CD4+ and/or CD8+ T lymphocytes. A higher percentage of CD4+ T lymphocytes producing IFN- in AD dogs was also observed. Morever, in M + CD4+ and M + CD4+ and CD8+, a higher frequency of NO producing macrophages was observed in AD, compared with SD. Finally, through correlation analysis, possible interconnections between the evaluated variables were assessed. Parameters, such as, IL-12 expression, frequency of CD4+ T lymphocytes producing IFN- and frequency of NO producing macrophages were intimately connected and associated with resistance. On the other hand, splenic expression of IL-10, splenomegaly and high parasitism were highly associated and related to susceptibility against L. infantum infection.
Description: Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa de Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto.
URI: http://www.repositorio.ufop.br/handle/123456789/10514
metadata.dc.rights.license: Autorização concedida ao Repositório Institucional da UFOP pelo(a) autor(a) em 09/11/2018 com as seguintes condições: disponível sob Licença Creative Commons 4.0 que permite copiar, distribuir e transmitir o trabalho desde que sejam citados o autor e o licenciante. Não permite o uso para fins comerciais nem a adaptação.
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