PPCBIOL - Doutorado (Teses)
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Navegando PPCBIOL - Doutorado (Teses) por Assunto "Adenosina"
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Item Influência do metabolismo extracelular de ATP em infecções por parasitos do gênero leishmania.(Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto., 2008) Silva, Eduardo de Almeida Marques da; Afonso, Luís Carlos CroccoVariações nos quadros clínicos da leishmaniose, observadas tanto na doença em humanos quanto em murinos, sugerem a existência de uma diferenciação, dependente da espécie, na capacidade de parasitos do gênero Leishmania causarem lesões no hospedeiro. A procura de fatores que diferenciam as espécies de Leishmania quanto à sua virulência se faz, então, necessária para o entendimento dos mecanismos pelos quais esses parasitos causam danos aos seus hospedeiros, possibilitando a descoberta de novas ferramentas de potencial terapêutico contra a leishmaniose. Componentes da via de metabolismo do ATP extracelular são candidatos potenciais para fatores de virulência desses parasitos, visto que tanto o ATP quanto a adenosina, produto da hidrólise de AMP, são capazes de influenciar a resposta imunológica do hospedeiro e, conseqüentemente, o estabelecimento do parasito. Essa hipótese é suportada pelo fato da Leishmania necessitar da utilização da via de salvação de purinas pela ação de enzimas, dentre elas as apirases, sobre o ATP extracelular, que possui propriedades imunoestimulantes, para gerar adenosina, produto da hidrólise do AMP pelas 5’-nucleotidases, cuja importância para o metabolismo do parasito e para a regulação da resposta imune está bem descrita na literatura. Para testar essa hipótese, nós estudamos três espécies de Leishmania com diferentes graus de virulência em camundongos C57BL/6: a mais virulenta L. amazonensis e as espécies L. braziliensis e L. major. Inicialmente, formas promastigotas metacíclicas e procíclicas desses parasitos foram testadas para sua capacidade de hidrolisar ATP, ADP ou AMP. As formas metacíclicas (infectantes) de L. amazonensis mostraram maior capacidade de hidrólise para os três nucleotídeos analisados, quando comparadas com as outras duas espécies menos virulentas. Além disso, sua capacidade de hidrólise de ATP foi maior que a das formas procíclicas da mesma espécie, sugerindo um controle de expressão de ATPases dependente de metaciclogênese. Posteriormente, foi verificado pelas técnicas de RTPCR, e “Western blotting” que, a despeito da ocorrência de expressão de mRNA para as isoformas solúvel e de membrana de apirases nas promastigotas metacíclicas das três espécies estudadas, somente extratos enriquecidos de membrana de L. amazonensis foram capazes de apresentar reação com anticorpo anti-apirase de T. cruzi. O inóculo de promastigotas metacíclicas desse parasito na presença de suramina, um inibidor de ecto ATPases, em camundongos C57BL/6, levou a uma diminuição no tamanho de lesão a partir da quarta semana de infecção e no parasitismo em 7 semanas de infecção. Por outro lado, a indução de maior atividade 5’-nucleotidásica dos parasitos ou a administração simultânea de adenosina ao inóculo levou a um aumento transiente no tamanho de lesão e a um maior parasitismo em 3 ou 4 semanas de infecção da mesma cepa de camundongos por promastigotas metacíclicas de L. braziliensis, resultado oposto ao obtido após o tratamento, no momento do inóculo, com o bloqueador de receptores A2B de adenosina, MRS 1754. Em conjunto, esses resultados sugerem que a redução dos níveis de ATP extracelular pela ação de enzimas expressas pelo parasito e/ou a elevação dos níveis de adenosina podem contribuir para o estabelecimento de parasitos do gênero Leishmania no hospedeiro vertebrado, indicando um possível alvo para futuras intervenções de caráter terapêutico contra as leishmanioses.Item População leucocitária e expressão de CD39 e CD73 durante o curso da infecção por Leishmania amazonensis.(2019) Castro, Renata Alves de Oliveira e; Afonso, Luís Carlos Crocco; Afonso, Luís Carlos Crocco; Roatt, Bruno Mendes; Carneiro, Cláudia Martins; Gomes, Daniel Cláudio de Oliveira; Gonçalves, RicardoO ATP extracelular induz uma resposta inflamatória regulada por sua hidrólise à adenosina pela ação sequencial de CD39 e CD73. A adenosina, por outro lado, induz uma resposta anti- inflamatória. O objetivo deste estudo foi avaliar a cinética de migração celular, a expressão de CD39 e CD73 e a produção de citocinas em linfonodos que drenam uma infecção na orelha por L. amazonensis (103 metacíclicas), no modelo murino. A análise de citocinas (IFN- e IL-10) produzidas por cultura de células de linfonodo drenante nos tempos analisados demonstra um balanço, pró e anti-inflamatório, tanto nos tempos iniciais (baixas em 3 e 1 semana) quanto nos tempos tardios (alta em 7 e 10 semanas). Fotomicrografias das lesões de orelha evidenciam um atraso na formação do processo inflamatório e, a partir de 7 semanas, presença de infiltrado inflamatório misto. A análise por citometria de fluxo mostra aumento da população CD45+ e ectonucleotidases na orelha e linfonodo drenante em 7 e 10 semanas de infecção. Em 3 dias ocorre aumento da população CD45+ e expressão de CD39+ /CD73+ na orelha, independente do grupo analisado, provavelmente devido ao inóculo. No linfonodo, as APCs têm um aumento em 7 e 10 semanas e CD39 e CD73 estão em alta expressão. Na orelha, a população de macrófagos aumenta em 10 semanas de infecção com alta expressão de CD39 ou CD73. Os monócitos inflamatórios aumentam na orelha e linfonodo em 10 semanas com alta de ectonucleotidases. Os neutrófilos aumentam em 7 e 10 semanas no linfonodo e orelha, respectivamente e, têm aumento da expressão das enzimas. Os linfócitos TCD4+ aumentam no linfonodo em 7 semanas e regridem em 10 semanas, enquanto na orelha estão presentes apenas em 10 semanas com aumento da expressão de CD39. No linfonodo a população Treg, tem aumento em 7 e 10 semanas. Tanto na orelha quanto no linfonodo a população CD8+ /CD39+ está aumentada em 10 semanas, em um padrão de exaustão. As células NK estão aumentadas em 7 e 10 semanas no linfonodo e orelha com aumento de ectonucleotidases. Nossos resultados nos permitem concluir que existe correlação entre o aumento da população celular no infiltrado inflamatório da lesão e a expressão de ectonucleotidases durante o curso da infecção por L. amazonensis. Este padrão de enzimas exerce uma regulação importante que suplanta a ação das citocinas. As alterações celulares em linfócitos parecem apontar para uma similaridade entre o local de infecção por este parasito e o ambiente tumoral causada pela modulação do sistema imune por ectonucleotidases.Item Recrutamento do receptor de adenosina A2B e ativação da via de AMPc- PI3K-ERK1/2 inibem a resposta de células dendríticas infectadas por Leishmania amazonensis.(2016) Figueiredo, Amanda Braga de; Afonso, Luís Carlos Crocco; Gonçalves, Teresa Maria Fonseca de Oliveira; Cunha, Rodrigo Pinto dos Santos Antunes da; Brandão, Rogélio Lopes; Oliveira, Milton Adriano Pelli de; Faria, Ana Maria Caetano de; Antonelli, Lis Ribeiro do ValleA infecção por Leishmania pode resultar num amplo espectro de manifestações clínicas e a infecção por Leishmania amazonensis é associada a uma deficiência na resposta de linfócitos T específicos para o parasito. Células dendríticas direcionam a diferenciação de linfócitos Th1 que contribuem para o controle da infecção por Leishmania. Em um trabalho anterior, nós mostramos que a infecção por L. amazonensis, mas não por L. braziliensis ou L. major, prejudica a resposta de células dendríticas por um mecanismo dependente do receptor de adenosina A2B. Neste trabalho, nós avaliamos a expressão de receptores de adenosina e os eventos intracelulares ativados a partir do receptor A2B em células dendríticas infectadas, bem como o papel desses eventos na infecção de camundongos por L. amazonensis. Inicialmente, células dendríticas derivadas de células de medula óssea de camundongos C57BL/6J foram infectadas por promastigotas metacíclicas de L. amazonensis, L. braziliensis ou L. major. Imagens obtidas por microscopia de fluorescência mostraram que a infecção por promastigotas metacíclicas de L. amazonensis estimula a redistribuição do receptor A2B para a superfície de células dendríticas infectadas, sem alterar a quantidade total do receptor, avaliada por western blotting, nem a expressão dos receptores de adenosina A1, A2A e A3. A infecção por L. braziliensis, L. major ou promastigotas procíclicas de L. amazonensis não alteram a expressão do receptor A2B em células infectadas. Nossos resultados mostraram, ainda, que a infecção por L. amazonensis estimula a produção de AMPc e a fosforilação de ERK1/2 por mecanismos dependentes do receptor A2B. Além disso, L. amazonensis prejudica a expressão de CD40 e a produção de IL-12p70 por células dendríticas, efeitos independentes de IL-10 e revertidos pela inibição de adenilato ciclase, de PI3K e da fosforilação de ERK1/2. Por fim, camundongos infectados na orelha por L. amazonensis na presença de inibidores do receptor A2B ou das proteínas PI3K ou ERK1/2 desenvolvem lesões menores se comparados a animais controles, mas apenas o bloqueio do receptor A2B é capaz de diminuir o parasitismo tecidual. Concluindo, nós propomos um novo mecanismo utilizado por L. amazonensis (redistribuição do receptor A2B AMPc PI3K ERK1/2) para inibir a ativação de células dendríticas, que parece ser importante para a deficiência na resposta imune observada na infecção por essa espécie de parasito.