PPCBIOL - Doutorado (Teses)

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Análise bioinformática de transcritos da glândula de veneno da aranha – marrom Loxosceles intermedia e construção de baculovírus recombinantes como vetores de toxinas inseticidas.
(Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto., 2005) Castro, Cibele Soares de; Castro, Ieso de Miranda
Neste trabalho, objetivando a caracterização molecular de transcritos da glândula de veneno da aranha-marrom Loxosceles intermedia para a ampliação do banco de dados de toxinas, 268 seqüências foram agrupadas em 136 singlets e 33 consensos. Estas seqüências foram submetidas à anotação gênica para que fossem identificadas por meio de buscas de similaridade contra diferentes bancos de dados. Em seguida, foram classificadas em categorias funcionais, analisadas quanto a sua função biológica e, quando possível, modeladas por homologia para que verificássemos sua provável estrutura tridimensional. Além disso, a fim de produzir bioinseticidas de alta eficiência e especificidade, trabalhamos com toxinas de atividade letal para insetos de importância agrícola. Recentemente, a partir da purificação do veneno bruto de L. intermedia e da construção de uma biblioteca de cDNA das glândulas de veneno desta aranha, nosso grupo caracterizou toxinas com forte ação inseticida em larvas de Spodoptera frugiperda, a lagarta-do-cartucho do milho. Devido às dificuldades para se obter do veneno bruto as toxinas identificadas por biologia molecular, o uso de sistemas de expressão heterólogos torna-se necessário tanto para o estudo dos genes isolados dessas toxinas quanto para a sua obtenção em grandes quantidades. Um dos sistemas heterólogos de controle a pragas mais estudados em nível nacional e internacional é aquele que utiliza baculovírus no combate a diversas pragas agrícolas. O sistema baculovírus supera em vários aspectos os sistemas tradicionais de inseticidas químicos, sendo considerado por diversos autores como seguro ao meio ambiente e ao homem e, também, apresentando potencialmente um custo final por hectare menor do que o dos inseticidas químicos. Assim, realizamos - através da subclonagem em vetores de transferência do sistema de expressão baculovírus - a inserção dos genes das toxinas inseticidas LiTx1, LiTx2 e LiD1 (previamente identificadas a partir da glândula de veneno de L. intermedia) ao genoma do baculovírus AcMNPV. O sucesso da construção dos vírus recombinantes foi verificado após infecção de células de inseto e também por PCR. A expressão das toxinas LiTx1, LiTx2 e LiD1 foi verificada por RT-PCR, SDS-PAGE e Western Blotting. Bioensaios com os vírus recombinantes LiTx1 e LiTx2 em larvas de S. frugiperda demonstraram sua eficácia inseticida, com diminuição do tempo de vida desta lagarta, quando comparada aos vírus selvagens. Acreditamos que os baculovírus recombinantes aqui gerados poderão permitir a expressão em larga escala das toxinas LiTx1, LiTx2 e LiD1 de L. intermedia. Isso possibilitará a realização de estudos de caracterização dessas toxinas inseticidas quanto aos seus mecanismos de ação e permitirá também sua utilização como ferramentas na pesquisa básica para estudos de canais iônicos e outros processos fisiológicos.
Caracterização molecular e bioquímica de cepas de Saccharomyces cerevisiae utilizadas na caracterização molecular e bioquímica.
(Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto., 2007) Vicente, Maristela de Araújo; Brandão, Rogélio Lopes
Com o objetivo de caracterizar molecularmente a cepa Saccharomyces cerevisiae LBCM 427, selecionada a partir de dornas de fermentação de cachaça, utilizaram-se várias metodologias de análise de polimorfismo de DNA para permitir a discriminação entre esta e as cepas presentes no local de origem. Os resultados demonstraram que RAPD-PCR, mtDNA, e PCR utilizando primers complementares a região do gene COXI não foram suficientes para uma boa diferenciação entre a cepa LBCM 427 e cepas isoladas na mesma dorna de fermentação. Por outro lado, o uso da cariotipagem para diferenciação com base no perfil cromossomal permitiu uma nítida distinção entre o grupo de cepas analisadas. Estes resultados demonstram que o uso de cepas iniciadoras requer um acompanhamento com o uso combinado de métodos bioquímicos e moleculares. A cepa parenteral LBCM 427, foi segregada e as tétrades analisadas quanto a estabilidade fisiológica e bioquímica em passagens sucessivas. Avaliaram-se os seguintes parâmetros floculação, não produção de H2S, resistência a 5,5´,5´´-trifluoro-DLleucina (TFL) e cerulenina, crescimento em diferentes condições de pressão osmótica e de temperatura. Os resultados demonstraram que nenhuma cepa segregante reuniu todas as características da cepa parental. Diante disto, foi selecionada uma cepa segregante que atendia ao critério de resistência a TFL e cerulenina para analisar o comportamento em uma fermentação em caldo de cana e possíveis mutações no gene LEU4 que transcreve para a - isopropilmalato sintase. Esta segregante não foi afetada na presença de altas concentrações de L-leucina (20 mM) e, apresentou mutações no gene LEU4 ainda não descritas pela literatura. A cepa LBCM 427 e segregante foram avaliadas quanto à produção de cachaça em escala piloto. Os parâmetros analisados foram: o perfil químico da bebida produzida e a adaptação das cepas em condições similares às encontradas na fabricação artesanal da cachaça. Por cromatografia gasosa, quantificaram-se os compostos voláteis sendo estes o acetaldeído, acetato de etila, metanol, n-propanol, isobutanol, álcool isoamílico, e furfural. Verificou-se que as cepas LBCM 427 e segregante produzem elevados teores de álcool isoamílico e álcool isobutílico quando comparadas a uma cepa Saccharomyces cerevisiae comercial utilizada como controle. Outra cepa utilizada como controle do processo, a cepa nativa LBCM 422, sensível a ambos compostos, produziu quantidades semelhantes de álcool isoamílico quando comparada às cepas LBCM 427 e segregante, resistentes a TFL e cerulenina. Os resultados apresentados oferecem uma importante contribuição para o desenvolvimento de novas estratégias de seleção de cepas selvagem com características específicas, levando a produção da cachaça com maior produção de compostos flavorizantes.
Avaliação da imunogenicidade de dois novos Imunobiológicos candidatos a vacina contra Leishmaniose visceral canina.
(Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto., 2007) Giunchetti, Rodolfo Cordeiro; Reis, Alexandre Barbosa
Considerando a importância de estratégias imunoprofiláticas para o controle da leishmaniose visceral, a inexistência de drogas capazes de curar cães infectados e o aumento de casos de resistência aos antimoniais pentavalentes, o presente trabalho buscou avaliar a imunogenicidade de dois novos imunobiológicos candidatos a vacina contra leishmaniose visceral canina (LVC). Observa-se uma lacuna em estudos que buscam avaliar a imunogenicidade pós-vacinal de imunobiológicos anti-LVC. Assim, o presente estudo propôs uma análise detalhada da imunogenicidade considerando diversos biomarcadores da resposta imune celular e humoral após as três doses das diferentes estratégias vacinais. Trinta e cinco cães sem raça definida foram subdivididos em sete grupos experimentais, entre os quais: (i) grupo controle C (n = 10) que recebeu 1 mL de salina estéril a 0,9%; (ii) grupo LB (n = 5) que recebeu 600 μg de proteína de Leishmania braziliensis em 1 mL de salina estéril a 0,9%; (iii) grupo Sap (n = 5) que recebeu 1 mg de saponina em 1 mL de salina estéril a 0,9%; (iv) grupo LBSap (n = 5) que recebeu 600 μg de proteína de L. braziliensis associado a 1 mg de saponina em 1 mL de salina estéril a 0,9%; (v) grupo Sal (n = 5) que recebeu extrato de glândula salivar de Lutzomyia longipalpis (SGE) equivalente ao conteúdo de 5 ácinos da glândula salivar em 1 mL de salina estéril a 0,9%; (vi) grupo LBSal (n = 5) que recebeu 600 μg de promastigotas de L. braziliensis associado ao SGE em 1 mL de salina estéril a 0,9%; (vii) grupo LBSapSal (n = 5) que recebeu 600 μg de promastigotas de L. braziliensis associado a 1 mg de saponina e ao SGE em 1 mL de salina estéril a 0,9%. Cada animal recebeu três aplicações subcutâneas no flanco esquerdo em intervalos de quatro semanas. Os resultados indicam que a saponina quando presente (Sap, LBSap, LBSapSal) induziu em alguns cães a formação de edema ou de pequeno nódulo local, sem apresentar lesões ulceradas ou outras alterações adversas. A avaliação da inocuidade e toxicidade das diferentes vacinas não revelou contra-indicações para utilização. A avaliação da resposta humoral revelou que os grupos LBSap e LBSapSal apresentaram aumento dos níveis de IgG total, IgG1 e IgG2 anti-Leishmania, sugerindo um perfil de resposta imune misto Th1/Th2. De forma semelhante, no grupo LBSapSal foi observado aumento dos níveis de IgG total, IgG1 e IgG2 anti-SGE, que tem sido previamente relacionado ao estabelecimento de uma resposta imune protetora anti- Leishmania. Além disto, experimentos utilizando Western blot para avaliar a reatividade de anticorpos caninos anti-proteínas do SGE evidenciaram o predomínio de proteínas com peso molecular de 35, 45 e 75 KDa, particularmente no grupo LBSapSal, sendo relacionado a um padrão de resistência contra infecção por Leishmania. A avaliação da resposta celular contou com o estudo imunofenotípico de células mononucleares do sangue periférico (PBMC) e revelou aumento do número de linfócitos B CD21+, linfócitos T CD5+ e das subpopulações T (CD4+ e T CD8+), indicando o estabelecimento de imunidade protetora contra infecção por Leishmania como previamente relatado na LVC. Além disto, foi observada pela análise in vitro redução do índice de proliferação utilizando VSA (vaccine soluble antigen) ou SLcA (soluble Leishmania chagasi antigen) nos grupos LB e Sal, enquanto os grupos LBSap e LBSapSal apresentaram aumento da atividade linfoproliferativa na presença de ambos os estímulos. De forma interessante, foi demonstrado no grupo Sal correlação negativa entre a atividade linfoproliferativa e linfócitos T CD4+ ou monócitos CD14+. Estes resultados permitem especular que a imunização realizada no grupo Sal poderia inibir a atividade de monócitos CD14+ em ativar linfócitos T CD4+ e assim reduzir a atividade linfoproliferativa. Por outro lado, PBMC cultivados in vitro com SLcA do grupo LBSap e com VSA ou SLcA no grupo LBSapSal apresentaram aumento da atividade XI linfoproliferativa acompanhada pela indução de linfócitos T CD8+ antígeno-específicos. Estes resultados sustentam a hipótese de que a vacinação com LBSap e LBSapSal estimularia o desenvolvimento de mecanismos imunoprotetores relacionados ao controle do parasitismo por Leishmania considerando a indução de linfócitos T CD8+ antígeno-específicos para proteínas relacionadas ao agente etiológico da LVC. A avaliação de potenciais células apresentadoras de antígenos (APC) revelou aumento do número de monócitos CD14+ circulantes nos grupos LBSap e LBSapSal. Além disto, altas contagens de APC foram associadas ao aumento da expressão de linfócitos MHC-I no grupo LBSap e de linfócitos CD80 e MHC-I no grupo LBSapSal, sugerindo que esta associação poderia representar a interação entre as respostas imunes inata e adaptativa, refletindo no aumento do perfil de ativação durante as imunizações. Os resultados obtidos pelas análises dos níveis de óxido nítrico (NO) pela avaliação dos níveis de nitrito no sobrenadante de cultura estimuladas com SLcA no grupo LBSap e no soro do grupo LBSapSal confirmam a hipótese de que estas vacinas induzem um perfil associado a resistência contra a infecção por Leishmania. Os resultados obtidos neste trabalho indicam que o potencial imunoprotetor induzido pelas vacinas LBSap e LBSapSal são compatíveis com o controle do agente etiológico da LVC.
Análise comparativa da expressão gênica nas cepas selvagem W303 e pkc1∆ de Saccharomyces cerevisiae durante o processo de desrepressão metabólica.
(Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto., 2007) Tótola, Antônio Helvécio; Brandão, Rogélio Lopes
A levedura Saccharomyces cerevisiae possui uma via MAP quinase de transdução de sinais composta por Pkc1p, Bck1p, Mkk1p e Mkk2p, e Mpk1p. Já foi descrito que esta via está envolvida no controle da integridade da parede celular, na resposta ao estresse osmótico, no crescimento de pseudo-hifas e no controle do metabolismo de carbono. Neste trabalho investigamos a participação de Pkc1p no controle da expressão de genes envolvidos no metabolismo de carbono. Para isto, fizemos uma analise da expressão gênica global através de microarranjos de DNA comparando a resposta global sob condições de repressão e desrepressão metabólica no mutante a pkc1∆ e na cepa selvagem correspondente W303. Os resultados obtidos indicaram uma diferença significativa na expressão global dos genes nas duas cepas analisadas. Vinte e oito genes envolvidos no metabolismo de carbono foram selecionados para validação por RT-PCR e os resultados confirmaram que sete genes foram mais expressos na cepa W303 quando comparada com a cepa e quatro genes foram mais expressos na cepa pkc1 ∆ quando comparada com a cepa selvagem. Análises “In silico” apontaram três fatores de transcrição Sok2p, Crz1p and Gcr1p, que podem estar envolvidos no controle da expressão gênica por Pkc1p. Experimentos utilizando plasmídeos contendo o gene da β- galactosidase sob controle dos promotores dos genes CYC1, HXT1 e SUC2 mostraram que a expressão destes genes se apresentava diminuída na cepa pkc1∆ para o gene HXT1, aumentada para o gene CYC1 e igual para o gene SUC2 quando comparada com a cepa selvagem W303. A atividade de Invertase apresenta-se significativamente diminuída na cepa pkc1 ∆ quando comparada com a cepa selvagem W303. Nossos resultados confirmam a participação da proteína Pkc1p na regulação da expressão gênica durante o processo de desrepressão metabólica.
Influência do metabolismo extracelular de ATP em infecções por parasitos do gênero leishmania.
(Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto., 2008) Silva, Eduardo de Almeida Marques da; Afonso, Luís Carlos Crocco
Variações nos quadros clínicos da leishmaniose, observadas tanto na doença em humanos quanto em murinos, sugerem a existência de uma diferenciação, dependente da espécie, na capacidade de parasitos do gênero Leishmania causarem lesões no hospedeiro. A procura de fatores que diferenciam as espécies de Leishmania quanto à sua virulência se faz, então, necessária para o entendimento dos mecanismos pelos quais esses parasitos causam danos aos seus hospedeiros, possibilitando a descoberta de novas ferramentas de potencial terapêutico contra a leishmaniose. Componentes da via de metabolismo do ATP extracelular são candidatos potenciais para fatores de virulência desses parasitos, visto que tanto o ATP quanto a adenosina, produto da hidrólise de AMP, são capazes de influenciar a resposta imunológica do hospedeiro e, conseqüentemente, o estabelecimento do parasito. Essa hipótese é suportada pelo fato da Leishmania necessitar da utilização da via de salvação de purinas pela ação de enzimas, dentre elas as apirases, sobre o ATP extracelular, que possui propriedades imunoestimulantes, para gerar adenosina, produto da hidrólise do AMP pelas 5’-nucleotidases, cuja importância para o metabolismo do parasito e para a regulação da resposta imune está bem descrita na literatura. Para testar essa hipótese, nós estudamos três espécies de Leishmania com diferentes graus de virulência em camundongos C57BL/6: a mais virulenta L. amazonensis e as espécies L. braziliensis e L. major. Inicialmente, formas promastigotas metacíclicas e procíclicas desses parasitos foram testadas para sua capacidade de hidrolisar ATP, ADP ou AMP. As formas metacíclicas (infectantes) de L. amazonensis mostraram maior capacidade de hidrólise para os três nucleotídeos analisados, quando comparadas com as outras duas espécies menos virulentas. Além disso, sua capacidade de hidrólise de ATP foi maior que a das formas procíclicas da mesma espécie, sugerindo um controle de expressão de ATPases dependente de metaciclogênese. Posteriormente, foi verificado pelas técnicas de RTPCR, e “Western blotting” que, a despeito da ocorrência de expressão de mRNA para as isoformas solúvel e de membrana de apirases nas promastigotas metacíclicas das três espécies estudadas, somente extratos enriquecidos de membrana de L. amazonensis foram capazes de apresentar reação com anticorpo anti-apirase de T. cruzi. O inóculo de promastigotas metacíclicas desse parasito na presença de suramina, um inibidor de ecto ATPases, em camundongos C57BL/6, levou a uma diminuição no tamanho de lesão a partir da quarta semana de infecção e no parasitismo em 7 semanas de infecção. Por outro lado, a indução de maior atividade 5’-nucleotidásica dos parasitos ou a administração simultânea de adenosina ao inóculo levou a um aumento transiente no tamanho de lesão e a um maior parasitismo em 3 ou 4 semanas de infecção da mesma cepa de camundongos por promastigotas metacíclicas de L. braziliensis, resultado oposto ao obtido após o tratamento, no momento do inóculo, com o bloqueador de receptores A2B de adenosina, MRS 1754. Em conjunto, esses resultados sugerem que a redução dos níveis de ATP extracelular pela ação de enzimas expressas pelo parasito e/ou a elevação dos níveis de adenosina podem contribuir para o estabelecimento de parasitos do gênero Leishmania no hospedeiro vertebrado, indicando um possível alvo para futuras intervenções de caráter terapêutico contra as leishmanioses.
Tratamento com benzonidazol em camundongos infectados com misturas de populações do Trypanosoma cruzi pertencentes aos genótipos principais.
(Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto., 2008) Martins, Helen Rodrigues; Lana, Marta de
O objetivo desse trabalho foi avaliar o impacto de infecções mistas por clones de Trypanosoma cruzi pertencentes aos quatro genótipos principais na eficácia terapêutica do Benzonidazol (BZ) em camundongos BALB/c. Para esta proposta, foram empregados dois clones do T. cruzi de cada genótipo com diferentes níveis de virulência e de susceptibilidade ao BZ, que foram combinados aos pares totalizando 24 misturas distintas avaliadas comparativamente às respectivas monoinfecções. O tratamento com BZ reduziu os níveis de parasitemia além de outros parâmetros relacionados na maioria das infecções mistas, exceto nas da combinação dos genótipos 39+32. As taxas de mortalidade dos animais tratados (IT) e seus controles (INT) não diferiram significativamente entre as monoinfecções e as infecções mistas. A cura após tratamento foi definida empregando o critério de cura clássico, proposto por Krettli & Brener (1982) por meio de métodos parasitológicos (exame de sangue a fresco-ESF, hemocultura-Hc e PCR no sangue) e sorológicos (ELISA e pesquisa de anticorpos antitripomastigotas vivos-AATV) e, permitiu classificar os animais em tratados não curados (TNC=72,2%), tratados curados (TC=19,1) e dissociados (DIS=8,7%). Em geral, o ESF apresentou baixa positividade para a detecção da falha terapêutica (18,1%). A Hc apresentou sensibilidade satisfatória para a maioria das infecções, exceto nos animais infectados com o genótipo 39 e com a combinação 39+32; enquanto a PCR foi o método parasitológico mais sensível, a despeito da diversidade genética do T. cruzi. Os dados demonstraram que a ELISA não deve ser utilizada em amostras coletadas antes de três meses após tratamento, uma vez que pode apresentar resultados falsos negativos. A AATV foi mais eficiente na categorização dos animais em relação à resposta terapêutica e na definição precoce de cura. Os dados do presente estudo elegem a AATV e a PCR em sangue como as técnicas mais adequadas para a definição precoce de cura após tratamento da fase aguda da infecção pelo T. cruzi no modelo murino. Um importante achado deste estudo foi a observação de resultados positivos da PCR em tecidos de animais considerados curados pelo critério clássico, sugerindo infecção residual. Uma importante questão levantada por esses resultados é se a cura parasitológica de fato existe. A avaliação dos perfis de susceptibilidade ao BZ das infecções mistas foi realizada pela comparação entre os índices de cura observado e o esperado e, revelou mudança em direção ao padrão de menor susceptibilidade ao BZ nas combinações 19+39 e 19+32. Entretanto, quando os resultados foram analisados em nível dos clones do T. cruzi, foram observadas mudanças em nove das 24 misturas tendo sido detectados tanto aumento como diminuição na susceptibilidade ao fármaco. A caracterização molecular da amostra Cuica cl1, até então considerada um clone, demonstrou ser constituída de fato por duas populações geneticamente distintas cuja dinâmica populacional pode mudar dependendo da manutenção laboratorial. Entretanto, essas duas populações não apresentaram diferenças no perfil de susceptibilidade ao BZ. Em geral, a PCR de microssatélites apresentou boa correlação com a análise de isoenzimas na identificação dos clones presentes nas amostras isoladas de animais TNC e INT e confirmou a relação filogenética previamente determinada entre os clones por meio das análises de isoenzimas e RAPD. Apesar da análise de microssatélites apresentar baixa eficiência na identificação dos clones diretamente no sangue e nos tecidos de animais INT e TNC, os resultados obtidos dessas amostras biológicas foram similares aos obtidos para clones caracterizados após o isolamento pela Hc. Foram detectadas misturas em 7,7% dos isolados provenientes de animais INT e TNC obtidos por Hc. Em algumas misturas, resultados interessantes foram detectados revelando a presença do clone mais susceptível nas monoinfecções. Considerando a estrutura clonal do T. cruzi, um resultado inesperado foi a identificação de 15,5% dos isolados apresentando subpopulações do parasito com alelos de microssatélites distintos comparados aos clones originais. Esses achados sugerem que em alguns casos o tratamento com Benzonidazol pode resultar em um desequilíbrio da relação parasito-hospedeiro e levar ao estabelecimento de um curso da infecção distinto. Em conjunto, esses achados sugerem que infecções mistas podem apresentar um importante impacto na eficácia terapêutica. Estudos futuros são necessários para o melhor entendimento dos mecanismos envolvidos nas mudanças genéticas e no perfil de susceptibilidade ao Benzonidazol observado nas infecções mistas e o real benefício do tratamento para o hospedeiro.
Resposta ao estresse ácido em Saccharomyces cerevisiae e efeito protetor do íon sódio na morte celular induzida por ácido.
(Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto., 2009) Sant'Ana, Gilzeane dos Santos; Castro, Ieso de Miranda
Saccharomyces boulardii é usada como probiótico para previnir ou tratar distúrbios gastrointestinais ocasionados pelo uso excessivo de antibióticos, ou em enterites agudas. A fim de exercer os efeitos benéficos, os probióticos devem ter um mecanismo que os protegem do estresse do ambiente gástrico intestinal. Neste trabalho analisamos as diferenças metabólicas na resposta ao estresse ácido de S. boulardii comparativamente a S. cerevisiae W303, bem como a proteção conferida pela adição do íon sódio nesta condição. Como esperado, S. boulardii exibiu maior tolerância ao meio gástrico simulado frente às outras linhagens de S. cerevisiae. Sob estas condições o baixo pH (pH 2) foi o principal fator responsável pela diminuição da viabilidade celular. Neste trabalho observamos que a adição de baixas concentrações de cloreto de sódio foi mais eficaz do que a adição de outros sais na proteção das células em condições de estresse ácido. O efeito protetor do Na+ na viabilidade de leveduras, sob condições ácidas, foi testado utilizando cepas de S. cerevisiae com deleções nos genes que codificam proteínas envolvidas na homeostase de sódio, como por exemplo, os genes que codificam para a bomba Na+ATPase (ena1-4Δ) e genes codificadores dos canais trocadores Na+/H+ (nha1Δ) e Na+/H+ pré-vacuolar (nhx1Δ). O efeito protetor de NaCl está relacionado à influência do íon Na+ no potencial elétrico de membrana citoplasmática. Além disso, a ausência ou baixa expressão do gene que codifica para a proteína Ena1-4p sugere uma relação direta com os níveis basais do potencial de membrana citoplasmática das células de leveduras. É provável que a resistência de S. boulardii e do mutante ena1-4Δ ao estresse ácido (na ausência ou presença de NaCl), devese ao elevado potencial basal da membrana destas células e ao fato do íon sódio retardar a despolarização da membrana induzida pelo pH 2.0. Além disso, o maior conteúdo de trealose observado em S. boulardii pode ter contribuído para a resposta mais eficiente frente ao estresse ácido dos sinais metabólicos avaliados.
Estudo de propriedades funcionais do extrato de sementes de urucum (Bixa orellana L.) : alegações de redução do colesterol sérico e melhoramento do balanço redox.
(2009) Paula, Heberth de; Silva, Marcelo Eustáquio
O conceito de alimentos funcionais é complexo e varia de autor para autor. Em comum, são alimentos que não possuem apenas o objetivo de manutenção da vida ou de mera satisfação da fome. São alimentos que promoveriam um benefício para saúde, como por exemplo, a redução de risco de doenças crônicas não transmissíveis, como as doenças cardiovasculares. A demonstração destes efeitos para a saúde humana deve-se basear em evidências científicas. O interesse neste tipo de alimento vem crescendo consideravelemente no mundo ocidental, especialmente depois do início da década de 80. No mundo oriental, o interesse é mais antigo. Em várias culturas orientais, há uma forte convicção que os alimentos e os medicamentos provêm de uma mesma fonte e devem servir a um mesmo fim. Por outro lado, acreditamos que alimentos funcionais são e devem ser alimentos, não drogas. Os alimentos funcionais mais populares são as bebidas energéticas, produtos lácteos probióticos e cereais prontos para o consumo. A principal alegação de funcionalidade é para a saúde do sistema digestório (especialmente no Japão e na Europa), saúde cardíaca (especialmente nos Estados Unidos e Europa), promotores de defesas naturais e melhoradores dos níveis energéticos. O interesse por alimentos funcionais pode ser percebido pelos valores financeiros movimentados nos diversos países do mundo. Os Estados Unidos respondem pela metade dos produtos que possuem alguma alegação de saúde. Ainda neste país, esses produtos correspondem a 2% dos alimentos consumidos. Como as alegações de saúde dos alimentos são muitas, o enfoque deste estudo será as propriedades em reduzir o colesterol sérico e em melhorar o balanço redox fisiológico. Diversos alimentos têm sido estudados e mostrados serem capazes de auxiliar nestas propriedades, que contribuiriam para a redução dos riscos de doenças cardiovasculares. Foi mostrado que diversos carotenóides exerceriam estes efeitos benéficos. O urucum é uma planta originária da América do Sul, mais especificamente da região amazônica. É um arbusto que pode alcançar de 2 a 9 m de altura. É uma planta ornamental, pela beleza e colorido de suas flores e frutos. Apesar de sua utilização popular ter várias finalidades diferentes, o seu grande interesse está relacionado com a procura do corante natural na utilização das indústrias de medicamentos, de cosméticos, têxteis e, principalmente, de alimentos. O urucum é usado para fornecer tons que variam de amarelo a vermelho. Muitos componentes de diversas partes do urucum têm sido isolados e testados para a verificação de sua atividade biológica. Entre elas, podemos citar os derivados isoprenóides, terpenóides, hidrocarbonetos aromáticos e flavonóides. A superfície externa das sementes de urucum contém vários pigmentos carotenóides, dentre eles o mais abundante é conhecido como bixina (80%). O grande interesse em uso de corantes naturais está relacionado com as suas baixas toxicidades. Realmente o urucum se encaixa neste perfil e tem sido demonstrado que este corante não possui efeito tóxico e a ingestão diária aceitável está estabelecida em até 0,065mg/Kg de massa corporal expresso como bixina, que é o principal pigmento presente na sua semente. A comunidade local da região de Ouro Preto, MG, tem descrito que o urucum seria capaz de reduzir o colesterol sérico de pacientes hipercolesterolêmicos. Considerando esses aspectos, o objetivo principal do nosso trabalho foi avaliar a capacidade do extrato de sementes de urucum e de seus pigmentos em reduzir o colesterol sérico e regular o equilíbrio redox através de análises bioquímicas em ratos.
Efeitos das variações na homeostase de cálcio, sobre o processo de ativação, induzido por carboidratos, da H+- ATPase de membrana citoplasmática de Saccharomyces cerevisiae : papel do cálcio externo e do canal vacuolar Yvc1p.
(Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto., 2009) Cardoso, Anamaria de Souza; Brandão, Rogélio Lopes
A H+-ATPase de membrana plasmática de Saccharomyces cerevisiae é uma enzima muito importante, pois pelo bombeamento de prótons para fora da célula, ela cria um gradiente eletroquímico que é essencial para a captação de nutrientes. A presença de glicose desencadeia modificações pós-traducionais que aumentam a atividade da H+-ATPase. Trabalhos realizados em nosso laboratório demonstraram que a ativação da enzima, induzida por glicose, é dependente do metabolismo de cálcio e que nesta via, o sensor Snf3p, parece atuar de forma paralela a Gpa2p, e que sua cauda C-terminal é aparentemente responsável por este papel. Neste trabalho, nós observamos que em baixas concentrações de cálcio externo, o sinal de cálcio, e consequentemente a ativação induzida por glicose, da H+- ATPase de membrana plasmática, é independente da atividade de proteínas responsáveis pela captação de cálcio em S. cerevisiae. Nesta condição, as células parecem ser capazes de detectar as baixas concentrações de cálcio externo e de alguma forma controlar a atividade da Ca2+- ATPase vacuolar, Pmc1p. Nós apresentamos dados que sugerem que Yvc1p, um canal de cálcio de membrana vacuolar está envolvido no sinal de cálcio induzido por glicose em células de levedura. Além disso, trabalhando com a droga 2-aminoetoxidifenil borato (2-APB), um modulador de receptores de IP3 em células de mamíferos, fomos capazes de demonstrar que provavelmente o Yvc1p funcione como um receptor de IP3 ou pelo menos responda a um componente, ainda desconhecido, sensível ao mesmo, no sinal de cálcio induzido por açúcar. Nossos resultados também sugerem que Snf3p deve regular negativamente a atividade da Ca2+- ATPase, Pmc1p, inibindo o sequestro de cálcio citosólico. Investigando os braços paralelos que regulam nossa via de estudo, observamos no duplo mutante snf3Δplc1Δ, surpreendentemente, uma reversão dos fenótipos observados nos mutantes únicos. Este comportamento pode ser explicado pelo fato de que neste mesmo duplo mutante há uma ausência de acúmulo de cálcio e então as condições de concentração e localização deste íon sejam favoráveis a uma ativação normal da H+-ATPase . Finalmente, nós demonstramos que a proteína quinase C parece estar envolvida no sinal de cálcio induzido por açúcar em células de levedura. Muito provavelmente ela participe do controle da H+-ATPase de membrana plasmática pela regulação dos níveis de cálcio e não pela fosforilação direta da enzima.
Estudo dos fatores de risco nutricionais, clínicos, bioquímicos e comportamentais para as doenças cardiovasculares na população do ensino fundamental de Ouro Preto, Minas Gerais, Brasil, 2006.
(Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto., 2009) Cândido, Ana Paula Carlos; Coelho, George Luiz Lins Machado
As doenças cardiovasculares (DCV) representam a principal causa de morbidade e mortalidade. Os fatores de risco cardiovasculares, tais como, hipertensão arterial, a obesidade, a dislipidemia, o sedentarismo e o diabetes mellitus iniciam-se já na infância. O objetivo principal do projeto foi identificar precocemente os riscos cardiovasculares na população estudada e estabelecer pontos de corte de medidas antropométricas que auxiliem a triagem nutricional. Estudo epidemiológico transversal de base populacional escolar foi realizado com indivíduos de 6 a 14 anos de idade. Uma amostra de 850 estudantes foi selecionada por processo aleatório simples estratificado pela proporção de escolares de acordo com o sexo, idade e número de alunos em cada escola. As seguintes variáveis foram incluídas: demográficas (sexo, idade), bioquímicas (colesterol total, HDL-c, LDL-c, triglicérides, glicose), clínica (pressão arterial), antropométricas (IMC, circunferência de cintura, percentual de gordura corporal pelas dobras cutâneas e pela impedância bioelétrica bipolar e tetrapolar), estágio puberal, peso ao nascer, atividade física, comportamento sedentário, socioeconômica (renda familiar) e história familiar (IMC e pressão arterial). A amostra foi composta de 47,6% meninos e 52,4% meninas. Observamos que 8,2% e 6,7% dos estudantes eram sobrepeso e obesos, respectivamente. Na avaliação bioquímica, foi observado que 23,7% dos alunos apresentam níveis limítrofes de colesterol, e 36,9% aumentados. 18,6% apresentaram níveis baixos de HDL, enquanto 24% apresentam níveis limítrofes e 5,8% níveis aumentados de LDL. Em relação aos triglicérides, 7,5% dos alunos apresentaram níveis elevados, sendo que 83% estão normais. Não foi observada alteração nos níveis de glicose de jejum. Observamos que 1,2% dos alunos eram pré-hipertensos, 1,2% eram hipertensos nível 1 e 1,5% hipertensos nível 2. Na análise da curva ROC, verificamos que a impedância bioelérica bipolar assim como o IMC são métodos de escolha para a triagem de adiposidade na população analisada e que a escolha dos métodos deve ser de acordo com o estádio de maturação sexual. Observamos uma associação de risco entre obesidade e IMC dos pais e entre as variáveis bioquímicas. Em relação a pressão arterial, observamos uma associação de risco com o IMC e o peso ao nascer. Observamos que 44,4% dos escolares estavam expostos a 2-3 fatores de risco e 8,2% a 4-6 fatores de risco cardiovasculares. Concluímos que a população analisada apresenta fatores de risco precoces, tais como excesso de peso, hipercolesterolemia, hipertensão arterial, sedentarismo, além de uma associação entre eles. Os pontos de corte estabelecidos podem auxiliar na detecção de adiposidade e dos riscos futuros para as doenças cardiovasculares.
Pesquisa de Rickettsia em animais sinantrópicos e domésticos em seus ectoparasitas em duas áreas de baixa endemicidade para febre maculosa brasileira da região leste de Minas Gerais, de 2005-2007.
(Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto., 2010) Milagres, Bruno Silva; Galvão, Márcio Antônio Moreira
A febre maculosa é uma doença transmitida por carrapatos e tem como agente etiológico bactérias do gênero Rickettsiia, envolvendo no ciclo da Febre Maculosa Brasileira, cães, roedores e marsupiais como reservatórios vertebrados e carrapatos e pulgas como seus vetores invertebrados com os humanos atuando como hospedeiros acidentais, e constituindo elo terminal no ciclo dessas bactérias. A patogenicidade atribuída a estes microorganismos é ainda desconhecida para varias espécies, bem como os fatores de risco, demográficos e sazonais relacionados às respectivas doenças ocasionadas. Para a realização deste estudo, foram selecionados dois municípios do estado de Minas Gerais com prévio histórico de ocorrência destas enfermidade em humanos, sendo dois casos recentes no município de Pingo D'água, localizado na região do Vale do Rio Doce e o município de Santa Cruz do Escalvado, localizado no Vale do Piranga, Zona da Mata Mineira, estado de Minas Gerais foco antigo para riquetsioses, que sofreu alteração recente em sua paisagem natural, devido a construção de uma usina hidrelétrica na localidade de Soberbo no ano de 2004. Assim, com o objetivo de melhor compreender a atual situação epidemiológica das riquetsioses nesses municípios, dentro de uma concepção de ocupação e transformação do espaço geográfico por ação antrópica, buscou-se avaliar o nível de contato destes agentes nas populações de animais domésticos e sinantrópicos, realizaram-se ensaios sorológicos e ferramentas da biologia molecular. Eqüinos, cães, roedores e gambás foram capturados e identificados, tendo sido ainda coletadas amostras de soro bem como ectoparasitas. Dos roedores capturados foram colhidas amostras de tecidos (fígado e baço), e dos gambás amostras de sangue total, sendo realizado ainda nestes animais colheita de material por swab anal. Das amostras de sangue, tecidos, ectoparasitas e swabs anal extraiu-se DNA, que foram amplificadas através de PCR usando oligonucleotídeos iniciadores para amplificação gênero específica do gene da citrato sintase (gltA). Os produtos amplificados obtidos foram visualizados em gel de agarose a 1,5%. Apenas amostras de ectoparasitas das espécies Amblyomma cajennense coletados de cães, eqüinos, gambás-Didelphis aurita e Ctenocefalides canis e Ctenocefalides felis em pulgas de gambás apresentaram resultados positivos à PCR. As amostras de soros de animais silvestres e domésticos foram investigadas quanto à presença de anticorpos reativos à antígenos de Rickettsia rickettsii, Rickettsia parkeri, Rickettsia felis, Rickettsia belli, Ricketssia rhipicephali e Rickettsia amblyommii pela Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI). Amostras que apresentaram títulos iguais ou superiores a 1:64 foram considerados positivas para Rickettsia. No município de Pingo D’ Água das 46 amostras de soros de roedores analisadas, dentre estas 31 da espécie Rattus rattus, 7 Oryzomys subflavus, 7 Nectomys squamipes e 1 Bolomys sp. 26 (83,88%) das amostras de R. rattus, seis (85,72%) das amostras de Oryzomys e Nectomys e a única amostra de soro de Bolomys analisada apresentaram resultados positivos para bacterias do grupo da febre maculosa. No município de Santa Cruz do Escalvado das 62 amostras de soro de roedores analisadas, dentre estas 32 da espécie R. rattus, 2 Oryzomys subflavus, e 23 Nectomys squamipes e 5 Akodon sp. 30 amostras de R. rattus testadas, 30 foram reativas à RIFI para Rickettsia do Grupo das Febres Maculosas, totalizando 93,75% das amostras. Os dados sorológicos obtidos nos municípios de Pingo D’ Água e Santa Cruz do Escalvado, apontam a espécie R. rattus como a mais representativa entre os roedores, o que a credencia para participação no ciclo enzoótico das riquetsioses nas referidas regiões. Levando em consideração o agravante de essa ser a espécie mais sinantrópica em relação às outras estudadas neste projeto, é importante atentar-se para o possível risco de dispersão de organismos do gênero Rickettsia por esses animais no município. Foram analisadas ainda 42 amostras de soros de eqüinos e 24 amostras de soros de cães provenientes de Pingo D’ Água, com reatividade sorológica contra riquétsias do GFM em 16 (38,09%) dentre as amostras de eqüinos e em duas (8,33%) dentre as amostras de cães. Em Santa Cruz do Escalvado foram analisadas 66 amostras de soros de eqüinos e 67 amostras de soros de cães, verificando-se uma sororeatividade contra riquétsias do GFM em dez (15,15%) dentre as amostras de soros de eqüinos e em 14 (20,89%) dentre as amostras de soros de cães. Das 38 amostras de soro de D. aurita coletados no município de Santa Cruz do Escalvado, em 16 verificou-se a presença de Rickettsia, sendo que em 42,1% dos soros foram reativos contra R. rickettsii, 39,5% contra R. parkeri, 18,4% contra de R. amblyommi e 2,6% contra R. felis. Os achados sorológicos e de biologia molecular obtidos neste trabalho recomendam a manutenção de uma vigilância epidemiológica permanente nos municípios estudados, bem como em seu entorno, buscando-se desta maneira evitar a ocorrência de novos casos humanos causada pela invasão destes focos naturais pelo homem ou pela dispersão de potenciais reservatórios e vetores de agentes riquetsiais para novas áreas do estado.
Aspectos imunológicos da infecção experimental em camundongos por formas tripomastigotas metacíclicas ou sanguíneas do Trypanosoma cruzi.
(Programa de Pós-Graduação em Engenharia Geotécnica. Núcleo de Geotecnia, Escola de Minas, Universidade Federal de Ouro Preto., 2010) Vieira, Paula Melo de Abreu; Carneiro, Cláudia Martins
As formas tripomastigotas metacíclicas e sanguíneas do Trypanosoma cruzi são funcionais em relação à interação parasito-hospedeiro e/ou invasão de células-alvo, entretanto elas diferem nas moléculas presentes na superfície. Assim, aspectos relacionados à variabilidade com que as formas infectivas do T. cruzi interagem com as células do hospedeiro podem levar a implicações fundamentais na resposta imune contra o parasito e, conseqüentemente, na evolução clínica da doença de Chagas. O recente aumento no número de imigrantes chagásicos em países não-endêmicos, podendo ocorrer a contaminação por transfusão sanguínea, torna importante a realização de estudos sobre o impacto da infecção por formas sanguíneas no curso da doença. Dessa maneira, o estudo da infecção pelas diferentes formas infectivas do T. cruzi durante a fase aguda da infecção, permitirá uma melhor compreensão dos mecanismos relacionados à patogênese da doença de Chagas. Baseado nisso, o objetivo deste trabalho foi avaliar as alterações relacionadas aos parâmetros imunológicos celulares durante a fase aguda da infecção experimental de camundongos por formas tripomastigotas metacíclicas (TM) ou sangüíneas (TS) da cepa Berenice-78 do Trypanosoma cruzi. Os animais do grupo TS apresentaram níveis mais precoces e elevados de parasitemia em relação aos animais do grupo TM durante os 42 dias de avaliados. A análise dos leucócitos do sangue periférico demonstrou um que a infecção por formas sanguíneas ocasiona em um perfil bimodal, com aumento dos leucócitos no 7o e 42o dia após a infecção, enquanto que a infecção por formas metacíclicas leva a um perfil unimodal, com aumento nessas células ocorrendo mais tardiamente, no 28o e 42o dia após a infecção. A avaliação na produção de citocinas intracitoplasmáticas por esplenócitos demonstrou que na infecção por forma TS ocorre uma produção precoce de TNF- acompanhada por uma produção mais tardia de IFN-, quando a parasitemia já esta sob controle. Diferente do observado na infecção por formas metacíclicas, a qual apresenta uma produção precoce de IFN-. Além disso, nos animais do grupo TS não ocorre uma inversão de um perfil inflamatório para um perfil imunomodulado, mesmo quando a parasitemia já esta sob controle, sendo que nos animais infectados por formas metacíclicas este evento é observado. Esses dados corroboram com a quantificação do infiltrado inflamatório cardíaco, no qual os animais do grupo TS apresentaram uma inflamação precoce (7o dia após a infecção) que se manteve elevado até o 42o dia após a infecção, demonstrando assim que nesses animais ocorre uma exacerbação do processo inflamatório. Nos animais do grupo TM foi observada uma redução no processo inflamatório cardíaco do 28o para o 42o dia após a infecção, confirmando assim que na infecção por formas metacíclicas ocorre um controle da inflamação. A análise das alterações histológicas esplênicas, também demonstrou maior severidade nas mesmas nos animais do grupo TS. Portanto, a interação inicial entre formas tripomastigotas metacíclicas e o hospedeiro vertebrado induz um perfil de resposta imunológica diferente daquela observada na infecção com formas tripomastigotas sanguíneas. Dessa maneira, observa-se que a infecção por formas tripomastigotas metacíclicas ocorre de forma mais silenciosa, promovendo uma resposta imune capaz não só de controlar o número de parasitos durante a fase aguda da infecção como também de estabelecer uma resposta imunoreguladora ao final da fase aguda, limitando assim o desenvolvimento das lesões associadas à doença de Chagas. Entretanto, a infecção por formas tripomastigotas sanguíneas ocorre de uma maneira mais alarmante e apesar de haver o controle da parasitemia, não há o estabelecimento de uma resposta imunoreguladora eficaz, levando assim há uma inflamação persistente.
Geomedicina : distribuição geográfica dos elementos químicos na água de abastecimento urbano e sua relação com os níveis séricos de elementos-traço na população de Ouro Preto, Minas Gerais, 2006-2007.
(Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto., 2010) Barbosa, Cléia Costa; Coelho, George Luiz Lins Machado
As doenças não-transmissíveis representam a principal causa de mortalidade e de incapacitação no mundo e são responsáveis por 59% dos 56,5 milhões de óbitos anuais. Ultimamente vem-se considerando o papel dos elementos-traço, que direta ou indiretamente podem ser fatores de risco ou de proteção para doenças. Em Ouro Preto/MG, apesar de existirem indícios sobre a relação da água contaminada com doenças não transmissíveis, as informações sobre o mapeamento da água consumida não são claras e as correlações com as análises em soro ainda não foram estudadas. Desta maneira, esse estudo descritivo teve como objetivo avaliar a correlação entre a concentração dos elementos químicos na água de abastecimento da área urbana e os níveis de elementos-traço no soro dos indivíduos, além de determinar a distribuição geográfica desses elementos. A amostra foi composta pela coleta em 392 domicílios/indivíduos selecionados por setor censitário, de forma aleatória, e 19 pontos da rede de abastecimento. As análises na água foram realizadas pelas técnicas: ICP OES, e voltametria cíclica e as no soro: ICP OES. As informações sobre serviços e infra-estrutura foram obtidas através de questionários e relatórios, envolvendo os 16 sistemas oficiais de abastecimento urbano, que compreendem 36 redes de distribuição de água. No período seco foram observadas concentrações de As, Fe, Mn, Cd e Pb acima das estabelecidas pelas leis vigentes. No período chuvoso, observaram-se alterações anômalas nos valores de Al, Cd, Pb e Fe. As análises do soro apresentaram concentrações de elementos-traço acima dos valores de referência para o Al, Cd, Fe, Mn, Pb, Sr, e apresentaram correlação significativa (p<0.05) entre as regiões geográficas para a ferritina, Pb e Li. Não houve associação significativa entre a dosagem dos elementos-traço no soro estudados e as concentrações observadas na água de abastecimento, mesmo entre os elementos comuns ao Quadrilátero Ferrífero. A média das concentrações de Pb sérico foi maior (p=0,010) entre os homens. Esse estudo delineou as características da água de abastecimento, observou a concentração de elementos-traço nos soros dos indivíduos e agregou novos eventos à saúde urbana de Ouro Preto/MG, fornecendo direcionamento aos gestores. Faz-se, portanto necessário uma maior atuação e controle dos órgãos municipais, sobre a água de abastecimento, visando à melhoria da qualidade de vida da população.
Evolução da cardiopatia chagásica em cães tratados com Benznidazol na fase crônica da infecção experimental pelo Trypanosoma cruzi.
(Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto., 2010) Santos, Fabiane Matos dos; Bahia, Maria Terezinha
A eficácia do tratamento com Benznidazol (Bz) na fase crônica da infecção e conseqüente prognóstico da cardiopatia chagásica permanece controversa. Neste estudo foram avaliados os efeitos do tratamento com Bz na evolução da cardiopatia chagásica crônica, utilizando cães infectados com a cepa Berenice-78 como modelo experimental. Os animais infectados foram divididos em dois grupos experimentais: (i) 12 cães tratados na fase crônica com 7,0 mg de Bz/kg, divididos em duas doses diárias, durante 60 dias; (ii) 12 cães mantidos como controles não tratados. Outros 8 animais constituíram o grupo controle não-infectado. A parasitemia foi monitorada pela PCR realizada em amostras de sangue e tecido muscular cardíaco coletados no 1o e 12o mês após o tratamento (MAT). A potente supressão da parasitemia, induzida pelo tratamento com Bz, foi observada pelos resultados negativos em 81,9% (9 de 11) dos animais tratados em relação a 36,3% (4 de 11) nos animais não tratados quando realizada a PCR no sangue coletado no 1o MAT. Resultados semelhantes foram observados na PCR do tecido muscular cardíaco, realizada no mesmo período, quando o kDNA do parasito foi detectado somente em 33%,3 (2 de 6) dos animais tratados e em 100% dos animais não tratados. Um aumento dos resultados positivos na PCR do sangue e tecido foi detectado 12 MAT. Este resultado foi verificado em 60% (3 de 5) no sangue e 80% (4 de 5) no tecido muscular cardíaco dos animais tratados. Para avaliação da cardiomegalia e função sistólica ou diastólica os animais foram examinados por ecocardiograma no 1o e 12o MAT. Foram mensurados os parâmetros fração de encurtamento, volume do Átrio Esquerdo (AE), fração de ejeção, volume diastólico e diâmetro sistólico do Ventrículo Esquerdo (VE). Após essa avaliação, metade dos animais foi eutanaziada para realização das análises histopatológicas no coração. O tratamento induziu uma redução de 20% a 36% de células inflamatórias e deposição intrafascicular de colágeno no 1o MAT. Nesta fase da infecção, não houve diferença significativa nos parâmetros ecocardiográficos mensurados entre os grupos de animais infectados (tratados ou não) e não infectados. Diferentemente, 12 MAT, as lesões cardíacas foram semelhantes entre os animais infectados (tratados ou não) e significativamente maiores que naqueles não infectados. Variáveis ecocardiográficas relacionadas com cardiomegalia e disfunção diastólica também foram semelhantes entre os animais infectados (tratados ou não) e significativamente maiores que nos animais não infectados. De modo interessante, o tratamento preveniu alterações na função sistólica, uma vez que não ocorreram diferenças na fração de ejeção e fração de encurtamento entre os animais tratados e não infectados. Esses resultados demonstram que o tratamento com Bz na fase crônica da infecção de cães é eficiente em prevenir as lesões cardíacas imediatamente após o tratamento e a função sistólica um longo tempo após o término do tratamento.
Participação e homeostase do ferro no diabetes tipo 1 em modelos animais.
(Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto., 2011) Silva, Maísa; Pedrosa, Maria Lúcia
O ferro está envolvido na formação de espécies reativas de oxigênio e tem sido postulado que o estresse oxidativo decorrente de uma sobrecarga de ferro está relacionado às complicações observadas no diabetes. O papel do ferro nesta patogênese tem sido sugerido principalmente pelo aumento da incidência de diabetes tipo 2 em diversas causas hereditárias de sobrecarga de ferro, como na hemocromatose. Há uma relação bidirecional entre os metabolismos de glicose e ferro, dessa forma a hiperglicemia pode contribuir para intensificar o estresse oxidativo desencadeado pelo ferro. Em alguns trabalhos, mas não em todos, parâmetros do status de ferro, como ferritina e saturação de transferrina, apresentam- se alterados em pacientes com diabetes tipo 2. Não está claro se esta relação também ocorre em pacientes com diabetes tipo 1 ou em indivíduos com uma sobrecarga de ferro adquirida, como por exemplo suplementação indiscriminada de ferro. Este estudo avaliou alterações na homeostase de ferro, carboidratos e lipídios e relacionou mecanismos moleculares envolvidos na inter-relação entre diabetes e ferro em modelos animais distintos. Os resultados mostraram que o hamster foi um melhor modelo experimental. Verificamos neste modelo uma potencialização dos níveis glicêmicos no diabetes causado pela suplementação com ferro, além do efeito do diabetes na homeostase do ferro. Assim, este modelo foi mais sensível em demonstrar a relação bidirecional entre o metabolismo de glicose e ferro. Por outro lado, verificamos que o aumento da expressão do mRNA do gene para PPAR alfa no fígado provocado pelo diabetes, não foi agravado pelo excesso de ferro, corroborando com alguns parâmetros do estresse oxidativo dosados no fígado destes animais. Em ratos observamos alterações no metabolismo de ferro causadas pelo diabetes. A expressão do mRNA hepático do receptor de transferrina foi aumentada pelo diabetes, porém a interação dos dois fatores ocasionou um aumento do mRNA da hepcidina, sugerindo que a homeostase do ferro é alterada pelo diabetes e níveis de ferro no organismo. Este trabalho possibilitou um entendimento maior da relação entre diabetes e excesso de ferro, revelando a capacidade do ferro em potencializar o diabetes, possivelmente devido sua capacidade pro-oxidante.
Extrato de urucum e β-caroteno alteram a sinalização redox em neutrófilos de ratas diabéticas através da regulação da expressão gênica da NADPH oxidase, superóxido dismutase e catalase.
(Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto., 2011) Rossoni Júnior, Joamyr Victor; Silva, Marcelo Eustáquio; Costa, Daniela Caldeira
Urucum (Bixa orellana L.) contém uma mistura de pigmentos amarelo-avermelhado devido à presença de vários carotenóides que possuem efeito antioxidante. É bem estabelecido que um dos elementos chave no desenvolvimento das complicações do diabetes é o estresse oxidativo. O sistema imunológico é vulnerável a danos oxidativos, porque algumas células desse sistema, tais como neutrófilos, produzem espécies reativas de oxigênio (EROs) e espécies reativas de nitrogênio (ERNs) como parte dos mecanismos de defesa do organismo para destruir os patógenos invasores. EROs/ERNs são produzidos excessivamente por neutrófilos podendo danificar componentes celulares essenciais e dessa forma causar as complicações vasculares no diabetes. Esse estudo avaliou os possíveis efeitos protetores do extrato de urucum sobre as EROs, óxido nítrico (NO) e sobre os mecanismos regulatórios envolvidos neste processo em neutrófilos de ratas diabéticas induzidas por aloxano. Foram feitos dois experimentos, com duração de 30 ou 7 dias, e em cada foram utilizados 48 ratas que foram divididas em seis grupos, a saber: controle (C), controle + extrato de urucum (CUr), controle + β-caroteno (Cβcar), diabético (D), diabético + extrato de urucum (DUr) e diabético + β-caroteno (Dβcar). O diabetes foi induzido com uma injeção intraperitoneal única de aloxano (150 mg/Kg). Os animais dos grupos C e D receberam dieta padrão (AIN-93M) e os grupos CUr, Cβcar, DUr e Dβcar receberam dieta padrão suplementada com 0,1% de extrato de urucum ou β-caroteno. Todos os animais foram sacrificados 30 ou 7 dias depois do início do tratamento e os neutrófilos foram isolados usando dois gradientes de densidade diferentes. As EROs e NO foram quantificados por ensaios de quimioluminescência ou espectrofotometria, respectivamente. No experimento de 30 dias, nossos resultados mostraram que os neutrófilos de animais diabéticos produziram significativamente mais EROs e NO do que seus respectivos controle e a suplementação com extrato de urucum ou β-caroteno foi capaz de modular a produção dessas espécies reativas. No experimento de 7 dias, os resultados mostraram que o tratamento com extrato de urucum ou β-caroteno foi capaz de diminuir a produção de EROs, os níveis de mRNA de p22phox e p47phox e aumentar a expressão do mRNA e a atividade de SOD e catalase em neutrófilos de ratas diabéticas. Esses resultados sugerem que o extrato de urucum e o β-caroteno possuem efeito antioxidante via inibição das subunidades da NADPH oxidase e aumento da atividade e expressão das enzimas antioxidantes. O extrato de urucum pode ter um potencial terapêutico na modulação do balanço EROs/NO induzidos pelo diabetes.
Estresse oxidativo, defesas antioxidantes e processo inflamatório na fase aguda da doença de Chagas experimental.
(Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto., 2011) Francisco, Amanda Fortes; Carneiro, Cláudia Martins
Neste trabalho foram avaliados marcadores de estresse oxidativo (substâncias reativas de ácido tiobarbitúrico, proteína carbonilada e nitrito + nitrato), defesas antioxidantes (superóxido dismutase e glutationa total), parasitemia e processo inflamatório hepático, cardíaco e muscular em animais infectados pela cepa Y do Trypanosoma cruzi ou não e submetidos ou não ao tratamento com Benzonidazol, à alterações nos estoques de ferro pelo uso do quelante Desferrioxanina e a suplementação com vitamina E na fase aguda da doença de Chagas experimental. Foram utilizados camundongos suíços divididos em 12 grupos. Para cumprir com o estabelecido acima o trabalho foi dividido em três abordagens. Na primeira abordagem foi avaliado o efeito do tratamento com Benzonidazol sobre estes parâmetros em animais não infectados ou infectados. Na segunda abordagem, os mesmos parâmetros foram avaliados em animais não infectados ou infectados submetidos à alteração dos estoques de ferro pelo uso da Desferrioxamina. Além disso, nesta abordagem também foi avaliado o efeito do tratamento com Benzonidazol no modelo de alteração dos estoques de ferro com Desferrioxamina não infectado ou infectado. A terceira abordagem envolveu a análise dos mesmos parâmetros anteriores em animais infectados que receberam suplementação com um antioxidante, a vitamina E. A esta última abordagem também foi somado o efeito adicional do tratamento com Benzonidazol. Com relação à primeira abordagem podemos sugerir que tratamento com Benzonidazol aumentou o estresse oxidativo e as defesas antioxidantes, porém, não foi capaz de alterar o processo inflamatório nos três órgãos avaliados. A segunda abordagem nos permitiu inferir que as alterações dos estoques de ferro pela Desferrioxamina promoveram aumento do estresse oxidativo, bem como promove um aumento dos sistemas de defesa antioxidante. As alterações nos estoques de Fe não tiveram efeito significativo em nenhum dos três órgãos avaliados. Embora o uso da Desferrioxamina pareça atrasar a queda dos níveis de nitrito + nitrato, já observado nos animais infectados, os níveis elevados dessa molécula coincidem com a redução dos níveis de parasitemia e do percentual de mortalidade. A terceira abordagem mostrou que a suplementação com vitamina E reduziu o estresse oxidativo e as defesas antioxidantes. O processo inflamatório hepático e muscular foi reduzido nos animais suplementados e tratados com Benzonidazol enquanto que o processo inflamatório cardíaco aumentou nos animais suplementados. Portanto, a suplementação com vitamina E associada ao tratamento com Benzonidazol poderia contribuir para a redução do estresse oxidativo no hospedeiro.
Impacto do tratamento com Benznidazol na evolução da doença de Chagas experimental - análise imunopatológica e funcional.
(Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto., 2011) Caldas, Ivo Santana; Bahia, Maria Terezinha
Considerando as controvérsias sobre a eficácia do tratamento específico com Benznidazol (Bz) na prevenção ou redução das lesões cardíacas crônicas, este projeto propôs avaliar a influência do tratamento específico na evolução da cardiopatia chagásica, utilizando como modelo experimental cães infectados por cepas do Trypanosoma cruzi sensíveis e resistentes ao Bz. As avaliações imunopatológicas e clínicas foram realizadas utilizando: (i) a avaliação da área ocupada pela inflamação e pela fibrose no músculo cardíaco (ii) avaliação dos níveis de expressão mRNA para citocinas no tecido cardíaco; (iii) avaliação da resposta proliferativa e morte por apoptose de células mononucleares do sangue periférico (CMSP) e quantificação da produção de citocinas no sobrenadante das CMSP dos animais ao longo da infecção; (iv) avaliação das possíveis interferências do tratamento com Bz sobre a evolução clínica da cardiopatia experimental, através da detecção das alterações eletrocardiográficas, em cães chagásicos tratados e não tratados. Nossos resultados mostraram que o tratamento específico induziu 100% de cura nos animais infectados pela cepa Berenice-78, e que não houve cura parasitológica entre os infectados pelas cepas VL-10 e AAS. O tratamento específico, de maneira geral, preveniu as lesões cardíacas dos animais curados, bem como as alterações eletrocardiográficas. De forma interessante, entre os animais não curados foi observado um padrão de resposta variável de acordo com a população do T. cruzi. Nos animais infectados pela cepa AAS foi detectada redução significativa do processo inflamatório e da fibrose no tecido cardíaco acompanhado de ausência de alterações eletrocardiográficas. De forma diferente, entre os animais infectados pela cepa VL-10, o tratamento não foi eficaz em reduzir tanto as lesões cardíacas quanto as alterações eletrocardiográficas. Os parâmetros imunológicos avaliados durante as fases aguda e crônica da infecção foram marcadamente influenciados tanto pela cepa do parasito quanto pelo tratamento específico. Foi possível correlacionar a intensidade das lesões cardíacas e a produção de imunoglobulinas (IgG, IgG1, IgG2) no soro e de citocinas (TNF-, IFN- e IL-10) no sobrenadante de CMSP, além da expressão de mRNA dessas citocinas no tecido cardíaco dos animais submetidos ou não à quimioterapia com o Bz. De forma geral, nossos resultados contribuirão para uma melhor compreensão do benefício do tratamento específico na evolução clínica e nos mecanismos imunopatológicos envolvidos na doença de Chagas.
Avaliação laboratorial e clínica de indivíduos chagásicos tratados com benzonidazol e não tratados residentes no município de Berilo, Vale do Jequitinhonha, MG.
(Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto., 2011) Assis, Girley Francisco Machado de; Lana, Marta de
Um dos maiores desafios na doença de Chagas é avaliar o impacto do tratamento etiológico nos parâmetros clínicos e laboratoriais dos pacientes tratados. Sendo assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar a efetividade do benzonidazol na evolução clínica dos pacientes chagásicos tratados e não tratados, residentes no município de Berilo, Vale do Jequitinhonha, MG. A primeira parte deste trabalho teve como propósito avaliar 94 pacientes chagásicos tratados há mais de 10 anos, utilizando sorologia convencional (ELISA, IFI e HAI), sorologia alternativa (rec-ELISA e FC-ALTA) e métodos parasitológicos (HC e PCR). A sorologia convencional permitiu categorizar os pacientes em três grupos: tratados não curados (TNC), tratados em avaliação (TEA) e tratados curados (TC), segundo o critério clássico de cura (negativação de dois testes sorológicos negativos) ou critério mais rigoroso (negativação de três testes sorológicos negativos). O critério clássico revelou 78,7% dos pacientes TNC, 8,5% TEA e 12,8% TC. Já o critério mais rigoroso revelou 63,8% dos pacientes TNC, 28,7% TEA e 7,4% TC. As associações de dois testes da sorologia convencional (ELISA+IFI, ELISA+HAI e IFI+HAI) foram avaliadas e demonstraram resultados semelhantes entre associações de ELISA+IFI e IFI+HAI com o critério mais rigoroso. A rec-ELISA e a FC-ALTA apresentaram resultados mais consistentes com o critério de cura mais rigoroso, mas cada teste revelou isoladamente um paciente negativo não revelado pela sorologia convencional. A HC revelou falha terapêutica em 17% (16/94) dos pacientes, todos categorizados como TNC por ambos os critérios. A PCR apresentou resultados negativos consistentes com os demais métodos sorológicos e parasitológicos empregados como critério de cura. A avaliação clínica revelou no grupo TC maior percentual de forma indeterminada, ausência de forma digestiva e menor percentual de forma cardíaca. A segunda parte deste trabalho avaliou comparativamente os resultados da efetividade terapêutica e evolução clínica de 29 dos 94 pacientes tratados na fase crônica da infecção, utilizando o critério de cura atual. Não foi observada cura parasitológica e nem mesmo queda sorológica em nenhum paciente em todos os períodos pós-tratamento. A HC revelou falha terapêutica em 10,3% (3/29) dos pacientes e a PCR apresentou um percentual de positividade de 58,6% (17/29). A avaliação clínica destes pacientes, treze anos pós-tratamento, revelou uma evolução progressiva em 27,6% (8/29) dos pacientes. O índice de evolução clínica dos pacientes tratados na forma indeterminada foi quatro vezes menor se comparado com aqueles que apresentavam alguma alteração cardíaca ou digestiva antes do tratamento. Na terceira parte deste trabalho foram avaliados os aspectos laboratoriais e clínicos de 58 pacientes chagásicos dos quais 29 foram tratados com benzonidazol há 13 anos e 29 não tratados. A HC apresentou maior percentual de positividade entre os não tratados quando comparados com os tratados (27,6% x 6,9%). Foi observada uma queda sorológica significativa no grupo tratado quando comparado com o não tratado, sendo esta mais elevada nos pacientes tratados na forma indeterminada. Os pacientes tratados apresentaram menor percentual de evolução clínica quando comparados com os não tratados (27,6% x 65,5%) e os tratados na forma indeterminada apresentaram menor índice de evolução quando comparados com os não tratados (1,3% x 4.3%). Em conjunto, estes resultados revelam um baixo percentual de cura parasitológica em pacientes chagásicos tratados na fase crônica da infecção, mas um melhor prognóstico da doença foi observado em pacientes tratados na forma indeterminada quando comparados com o grupo não tratados.
Prevenção da oxidação tecidual e modificações na expressão gênica da mTOR e MAFBx do músculo de ratos exercitados alimentados com as proteínas do soro do leite.
(Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto., 2011) Haraguchi, Fabiano Kenji; Pedrosa, Maria Lúcia
As proteínas do soro do leite (PSL) são aquelas que permanecem na porção aquosa do leite após a coagulação das caseínas. Apresentam alto valor nutricional, elevado teor de aminoácidos essenciais, em especial a leucina, como também peptídeos bioativos, que possuem, entre outras propriedades, atividade antioxidante. Atualmente, as PSL são extensivamente encontradas em diferentes produtos alimentares, especialmente naqueles destinados a atletas e praticantes de atividade física. Embora sejam aclamadas por favorecerem o anabolismo muscular, o conhecimento científico acerca dessa propriedade não está totalmente elucidado. Neste trabalho, avaliaram-se o efeito das PSL como fonte proteico-dietética sobre o crescimento muscular, a atividade antioxidante e a expressão gênica de proteínas do metabolismo proteico-muscular de ratos submetidos a um programa de exercício físico de resistência com pesos. Os resultados revelaram que dietas compostas de PSL preveniram a oxidação proteico-muscular induzida pelo exercício, inibiram a oxidação de proteínas hepáticas, assim como a formação de lipoperóxidos hepáticos e musculares, independentemente do exercício. Concomitantemente, observou-se que o exercício em associação à dieta composta de PSL promoveu significativo aumento na expressão gênica da mTOR - quinase integrante da via sinalizadora da síntese proteico-muscular. Além disso, animais alimentados com as PSL apresentaram acentuada redução da expressão gênica da MAFbx - enzima envolvida no processo de degradação proteico-muscular pela via ubiquitina-proteassoma, o que provavelmente resultou em animais com mais ganho de peso corporal e muscular. Dessa forma, os dados do presente trabalho sugerem que a combinação de exercício de resistência com pesos e a ingestão das PSL favorece o ganho de peso corporal e muscular e que essa indução

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