Navegando por Autor "Soares, Rodrigo Pedro Pinto"
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Item American tegumentary leishmaniasis : effectiveness of an immunohistochemical protocol for the detection of leishmania in skin.(2013) Alves, Cibele Fontes; Alves, Cíntia Fontes; Figueiredo, Maria Marta; Souza, Carolina Carvalho de; Coelho, George Luiz Lins Machado; Melo, Maria Norma; Tafuri, Washington Luiz; Raso, Pedro; Soares, Rodrigo Pedro Pinto; Tafuri, Wagner LuizBackground: American tegumentary leishmaniasis (ATL) is endemic in Latin America, where Brazil has over 27 thousand cases per year. The aim of the present study was to develop an immunohistochemical method (IHC) for ATL diagnosis. For this purpose, we used serum from a dog naturally infected with Leishmania (L) infantum (canine hyperimmune serum) as the primary antibody, followed by a detection system with a secondary biotinylated antibody. Methodology: Skin samples were obtained from 73 patients in an endemic area of Caratinga, Minas Gerais (MG) State, Brazil all testing positive for ATL with the Montenegro skin test, microscopy, and PCR. Canine hyperimmune serum of a dog naturally infected with Leishmania (L.) infantum was employed as a primary antibody in an immunohistochemical diagnostic method using streptavidin-biotin peroxidase. To assess the specificity of this reaction, IHC assays employing two monoclonal antibodies were carried out. As the polymer-based technology is less time-consuming and labor intensive than the IHC labeled streptavidin-biotin peroxidase method, we compared the two methods for all samples. Results: The IHC method detected ATL in 67 of the 73 cases (91.8%). Immunolabeled parasites were primarily detected inside macrophages either in the superficial or the deep dermis. Detection was facilitated by the high contrast staining of amastigotes (dark brown) against the light blue background. A lower detection rate (71.2%) was observed with the both of the monoclonal Leishmania antibodies compared to the canine hyperimmune serum. This may have been due to a nonspecific background staining observed in all histological samples rendering positive detection more difficult. The higher efficacy of the canine hyperimmune serum in the IHC method was confirmed by the method using streptavidin-biotin peroxidase as well as that with the polymer-based technology (biotin-avidin-free system). Conclusions: The data are encouraging with regard to validating IHC as a standard alternative method for ATL diagnosis.Item An alternative in vitro drug screening test using Leishmania amazonensis transfected with red fluorescent protein.(2013) Rocha, Marcele Neves; Corrêa, Célia Maria; Melo, Maria Norma; Beverley, Stephen M.; Martins Filho, Olindo Assis; Madureira, Ana Paula; Soares, Rodrigo Pedro PintoFluorescent and colorimetric reporter genes are valuable tools for drug screening models, since microscopy islabor intensive and subject to observer variation. In this work, we propose afluorimetric method for drugscreening using redfluorescent parasites. FluorescentLeishmania amazonensiswere developed aftertransfection with integration plasmids containing either red (RFP) or greenfluorescent protein (GFP)genes. After transfection, wild-type (LaWT) and transfected (LaGFP and LaRFP) parasites were subjected toflow cytometry, macrophage infection, and tests of susceptibility to current antileishmanial agents andpropranolol derivatives previously shown to be active againstTrypanosoma cruzi. Flow cytometry analysisdiscriminated LaWT from LaRFP and LaGFP parasites, without affecting cell size or granulosity. Withmicroscopy, transfection with antibiotic resistant genes was not shown to affect macrophage infectivity andsusceptibility to amphotericin B and propranolol derivatives. Retention offluorescence remained in theintracellular amastigotes in both LaGFP and LaRFP transfectants. However, detection of intracellular RFPparasites was only achieved in thefluorimeter. Murine BALB/c macrophages were infected with LaRFPparasites, exposed to standard (meglumine antimoniate, amphotericin B, Miltefosine, and allopurinol) andtested molecules. Although it was possible to determine IC50values for 4 propranolol derivatives (1, 2b, 3, and4b), all compounds were considered inactive. This study is thefirst to develop afluorimetric drug screeningtest forL. amazonensisRFP. Thefluorimetric test was comparable to microscopy with the advantage of beingfaster and not requiring manual counting.Item Cinética da resposta imune inata induzida por diferentes adjuvantes vacinais.(2013) Mathias, Fernando Augusto Siqueira; Reis, Alexandre Barbosa; Carneiro, Cláudia Martins; Reis, Alexandre Barbosa; Lima, Wanderson Geraldo de; Soares, Rodrigo Pedro PintoAdjuvantes são substâncias que atuam na resposta imune inata e quando combinadas a vacinas com antígenos específicos, são capazes de produzir uma resposta mais intensa ao antígeno alvo. Adjuvantes atuam de várias formas para apresentar um antígeno para o sistema imune. Podem atuar como um sistema de depósito para antígenos, apresentando o antígeno durante um longo período de tempo. Além disso, essas substâncias são extremamente atrativas para o desenvolvimento de novas formulações vacinais contra várias doenças como a leishmaniose visceral. Assim, o objetivo desse estudo foi avaliar a resposta imune induzida por uma dose única dos adjuvantes: Hidróxido de alumínio (Al(OH) 3), Adjuvante Completo de Freund (ACF), Montanide Pet Gel A (MPGA), glicopiranosil lipídio A (GLA-SE) e Resiquimod (R-848) inoculados na pele de camundongos. Animais sensibilizados com salina foram utilizados como grupo controle. Os dados obtidos após a sensibilização com os adjuvantes demonstraram que todos adjuvantes foram capazes de promover alterações hematológicas nos leucócitos totais, bem como nas diferentes subpopulações. A análise fenotípica do sangue periférico mostrou que os animais imunizados com o adjuvante ACF (12h), GLA-SE e R-848 (24h) tiveram uma redução na subpopulação de linfócitos T CD4+, enquanto que os adjuvantes R-848 (12h) e MPGA (24h) apresentaram uma redução inicial de linfócitos T CD8+. A população de linfócitos B CD19+ também foi avaliada, na qual foi possível observar alterações em todos os grupos, contudo, os animais sensibilizados com os adjuvantes Al(OH)3 e GLA-SE apresentaram um aumento inicial em 24h. Em relação às células NK CD49b+, demonstraram distintos perfis nas diferentes imunizações com os adjuvantes, onde os animais dois grupos Al(OH)3 e R-848 reduziram nos tempos de 24h e 12h respectivamente. Os animais dos outros grupos apresentaram um aumento tardio: ACF (96h), MPGA (168h) e GLA-SE (168h). A população de monócitos CD14+ também foi avaliada, e os resultados mostraram que todos os adjuvantes, com a exceção do MPGA (96h) apresentaram um aumento recente. A avaliação dos níveis séricos de óxido nítrico induzido pelos distintos adjuvantes foi realizada nesse trabalho. Nossos resultados demonstram que os adjuvantes Al(OH)3 e ACF não foram capazes de induzir produção de NO, em contraste com os outros adjuvantes que mostraram um aumento em 1h e 12h (R-848), 48h (GLA-SE) e 168h e 336h (MPGA). O estudo histomorfológico foi realizado no local da imunização para avaliar a habilidade dos adjuvantes promover recrutamento celular. Os animais inoculados com o adjuvante Al(OH)3 não apresentaram diferenças entre os tempos da cinética, todavia, difere do grupo controle em toda análise. Os outros grupos demonstraram aumento já nos tempos iniciais. Os animais inoculados com o adjuvante ACF mostraram um aumento no recrutamento entre os tempos de 12h à 48h. Os animais inoculados com o adjuvante MPGA mostrou aumento na migração a partir de 48h, o grupo GLA-SE mostrou aumento entre os temos de 12h e 168h e finalmente os animais inoculados com R-848 mostraram grande recrutamento nos tempos de 1h, 24h e 48h. Assim, nossos dados demonstraram que os adjuvantes vacinais induziram recrutamento celular para o local do inóculo bem como mudanças nas células presentes no sangue periférico. Contudo, essas alterações apareceram em tempos distintos, provavelmente devido ao fato de eles terem diferentes constituições e, portanto, perfis de respostas imunes distintas que devem ser consideradas na sua seleção como adjuvantes vacinais. Esses dados nos estimulam a dar prosseguimento nos estudos a fim de compreender melhor esses mecanismos para poder implementar em futuras formulações vacinais seguras e efetivas.Item A contribuição de sistemas de associação de adjuvantes no aumento da eficácia vacinal de dois novos imunobiológicos contra a infecção experimental por Leishmania infantum em camundongos Balb/c.(2018) Mathias, Fernando Augusto Siqueira; Reis, Alexandre Barbosa; Vieira, Paula Melo de Abreu; Silva, Glenda Nicioli da; Cota, Renata Guerra de Sá; Soares, Rodrigo Pedro Pinto; Lima, Wanderson Geraldo de; Reis, Alexandre BarbosaA leishmaniose visceral humana (LVH) e a leishmaniose visceral canina (LVC) são as mais relevantes doenças emergentes com alta prevalência na América Latina, sobretudo no Brasil. Apesar disso, ainda são limitados os avanços obtidos tanto no tratamento da doença quanto no desenvolvimento de vacinas com intuito de conter sua expansão. Em se tratando da busca por vacinas mais eficazes, os adjuvantes vacinais surgem como aditivos importantes, capazes de aumentar a imunogenicidade do antígeno ao induzir uma resposta imune intensa e prolongada. Novas abordagens têm testado sistemas de duas ou mais associações de adjuvantes na busca por uma resposta mais rápida e efetiva em comparação ao emprego dos adjuvantes isolados. Dessa forma, o objetivo desta tese foi avaliar a contribuição de sistemas de associação de adjuvantes no aumento da eficácia vacinal de novos imunobiológicos contra a infecção experimental por L.infantum em camundongos Balb/c. Para tanto, o estudo foi dividido em duas estapas. Primeiro, avaliamos os adjuvantes Saponina (SAP), Resiquimod (R-848) e Monofosforil Lipídio A (MPL) combinados em sistemas de associação duplas e tripla, nas doses de 25%, 33% e 50% referente a dose total de cada adjuvante, a fim de estabelecer o melhor sistema bem como sua dose ideal. Animais inoculados com solução salina foram utilizados como grupo controle e todos experimentos foram conduzidos em duplicata. Os animais foram divididos em 16 grupos experimentais (n=6/grupo), Controle Salina (CS), Saponina (SAP), Monofosforil Lipídio A (MPL), Resquimod (R-848), e as associações SAP+MPL (SM), SAP+R-848 (SR), MPL+R-848 (MR) e SAP+MPL+R-848 (SMR), nas doses supracitadas. Os animais receberam uma dose única pela via intradérmica e passadas 48 horas foram eutanasiados para obtenção do fragmento de pele do local do inóculo. Metade do fragmento foi destinado para dosagem de quimiocinas (CCL2, CCL3, CCL4, CCL5 e CXCL1) e citocinas (IL-2, IFN-, TNF-, IL-4 e IL-10) por Cytometric Bead Array (CBA) e a outra metade para avaliações histológicas. Dentre todos os sistemas avaliados, SM50 levou ao aumento da produção de todas as quimiocinas e da citocina TNF-, enquanto SMR50 aumentou os níveis das quimiocinas CXCL1, CCL2 e CCL5 e citocinas TNF- e IFN- quando comparadas ao grupo controle. Além disso, SM50 apresentou aumento do infiltrado inflamatório, com aumento do percentual da população de macrófagos, enquanto que SMR50 também apresentou aumento no percentual de macrófagos. Após estes resultados, ambos os sistemas foram escolhidos para serem associados com o antígeno total de Leishmania braziliensis para compor duas novas vacinas na etapa 2, nas quais foi avaliado o efeito do sistema de associação de adjuvantes sobre a imunogenicidade e eficácia vacinal. Camundongos Balb/c foram divididos em 6 grupos experimentais (n=5/grupo), Controle Salina (CS), grupo imunizado com antígeno total de L. braziliensis (LB), os sistemas de associação dupla e tripla de adjuvantes, SAP+MPL e SAP+MPL+R-848, ambos nas doses de 50%, e outros dois grupos que combinavam o antígeno total de L. braziliensis com os sistemas de associação de adjuvantes (LBSM50 e LBSMR50). Esses foram imunizados com três doses, com intervalo de 15 dias entre as doses, e desafiados com 1 x 107 promastigotas de L. infantum. Após 28 dias, os animais foram necropsiados, o baço foi coletado para avaliar a proliferação celular, produção de IL-2, TNF- e INF-, formação de células T de memória efetora e central, além da avaliação da carga parasitária tanto no baço quanto no fígado. Observou-se que o sistema LBSMR50 promoveu aumento na produção de TNF- por células TCD4+, entretanto sua principal ação foi sobre células TCD8+, promovendo aumento da proliferação celular, produção de TNF- e formação de células de memória efetora. Todavia, ambas as vacinas foram capazes de reduzir a carga parasitária no fígado. Diante do exposto, concluímos que o emprego de sistemas de adjuvantes utilizando doses reduzidas induzem uma resposta eficaz, pois uma vez que combinados com o antígeno promoveram não apenas ativação do sistema imune no baço como também a redução da carga parasitária no fígado, sugerindo que o uso desses sistemas aumentaram a eficácia vacinal no modelo murino.Item Eficácia da combinação de ravuconazol ou seu pró-fármaco E1224 com o metabólito sulfona do fexinidazol no tratamento da infecção experimental por Trypanosoma cruzi.(2014) Mota, Ludmilla Walter Reis; Diniz, Lívia de Figueiredo; Bahia, Maria Terezinha; Caldas, Ivo Santana; Soares, Rodrigo Pedro Pinto; Diniz, Lívia de FigueiredoO objetivo do presente estudo foi avaliar o efeito do tratamento com o derivado sulfona do fexinidazol (SfN) em combinação com o E1224 (pró-fármaco do ravuconazol- Rv) na infecção experimental por T. cruzi. Após a determinação dos valores de IC-50 de SfN e Rv sobre a infecção de células H9c2 pela cepa Y, foi determinada a natureza da interação entre esses fármacos in vitro. As células infectadas foram incubadas com os diferentes fármacos isoladamente ou combinados em proporções fixas. SfN e Rv não apresentaram interação in vitro na eliminação de formas amastigotas, resultando em efeito aditivo (média de ΣFIC= 1,08±0,7). Adicionalmente, as combinações de fármacos não induziram citotoxicidade em células H9c2 na ausência de infecção. A partir desses dados foi investigado o efeito in vivo das combinações usando modelo murino de infecção aguda. Nessa etapa camundongos Swiss fêmeas foram inoculados com formas tripomastigotas sanguíneas da cepa Y de T. cruzi. Após a detecção da parasitemia os animais foram tratados com doses subótimas de E1224 (2,5 e 5 mg por Kg de peso corporal-mg/Kg) e fex-sulfona (25 e 50mg/Kg), isoladamente ou em combinação por 20 dias. Foi também avaliado o efeito do tratamento na resposta imune humoral, por meio da detecção de anticorpos IgG anti-T-cruzi aos 180 dias após o tratamento. Os resultados mostraram que todos os tratamentos foram bem tolerados e eficientes em proteger os animais da mortalidade que acometeu 100% dos animais infectados e não tratados. A subdoses de SfN e E1224 quando combinadas foram mais eficientes em induzir cura do que quando usadas em monoterapia. Nos grupos tratados com E1224 nas doses de 2,5 e 5 mg/Kg, foi observada cura em 2/7 (28,5%) e 3/7 (42,8%) dos animais, respectivamente. No caso dos tratamentos com SfN, foi observada reativação natural da parasitemia em todos os animais. De forma interessante, nos grupos de animais tratados com ambas as combinações, 85,7% de cura foi observada, percentual próximo do obtido com a utilização de doses ótimas de cada fármaco. Esses resultados demonstraram o benefício resultante da administração combinada de SfN e E1224 in vivo e indicaram que combinações aditivas in vitro devem ser submetidas a avaliações in vivo.Item Estudo comparativo de cepas de Leishmania infantum – avaliação da susceptibilidade a antimoniais e da expressão de microRNAS em macrófagos J774.A1 e camundongos balb/c experimentalmente infectados.(2017) Silva, Stella Costa; Rezende, Simone Aparecida; Rezende, Simone Aparecida; Soares, Rodrigo Pedro Pinto; Lana, Marta deA Leishmania infantum é um protozoário agente etiológico da leishmaniose visceral, doença negligenciada e fatal na ausência de tratamento. Este protozoário pode apresentar variações biológicas, podendo alterar a expressão de microRNAs em macrófagos e em órgãos alvos da infecção. Os microRNAs são moléculas de RNA endógeno de cerca de 22 nucleotídeos, não codificadores de proteínas, envolvidos numa série de processos no organismo. Neste contexto, foi realizado um estudo comparativo utilizando duas cepas de L. infantum, a MHOM/BR/1972/BH46 e a MCAM/BR/2008/OP46, isoladas, respectivamente, de amostra humana e de cão sintomático naturalmente infectado. As cepas foram avaliadas em macrófagos J774.A1 e camundongos BALB/c. In vitro foram avaliadas a infectividade e a susceptibilidade a antimoniais. In vivo foi avaliada a carga parasitária no fígado, baço e medula óssea pela técnica de diluição limitante. A expressão do miR-122 e do miR-155, microRNAs que foi determinada, respectivamente, no fígado e no baço dos animais e a expressão do miR-155 foi também determinada nos macrófagos. Os resultados deste trabalho demonstraram que a cepa OP46 foi menos susceptível aos antimoniais utilizados. Observou-se uma maior carga parasitária no baço e medula óssea dos animais infectados com a cepa OP46 quando comparado com os animais infectados com a cepa BH46. Além disso, ocorreu um aumento na massa do baço dos animais infectados com a cepa OP46 quando este grupo foi comparado ao grupo de animais não infectados. Em relação à expressão dos microRNAs, observou-se diferença significativa na expressão do miR-155 em macrófagos infectados com as duas cepas em comparação com células não infectadas, sendo que os macrófagos infectados com a cepa OP46 mostraram uma maior expressão deste microRNA. No entanto, não houve diferença ao se analisar a expressão do miR-155 e do miR-122 in vivo. Assim, neste estudo foi observado que a cepa OP46 foi mais infectante para camundongos BALB/c, menos susceptível a antimoniais além de provocar um aumento na expressão de miR-155 em macrófagos infectados.Item Leishmania amazonensis from distinct clinical forms/hosts has polymorphisms in Lipophosphoglycans, displays variations in immunomodulatory properties and, susceptibility to antileishmanial drugs.(2022) Rêgo, Felipe Dutra; Cardoso, Camila Almeida; Moreira, Paulo Otávio Lourenço; Nogueira, Paula Monalisa; Araújo, Márcio Sobreira Silva; Borges, Valéria Matos; Laurenti, Marcia Dalastra; Bartholomeu, Daniella Castanheira; Reis, Alexandre Barbosa; Monte Neto, Rubens Lima do; Soares, Rodrigo Pedro PintoLipophosphoglycan (LPG), the major Leishmania glycoconjugate, induces pro‐ inflammatory/immunosuppressive innate immune responses. Here, we evaluated functional/biochemical LPG properties from six Leishmania amazonensis strains from different hosts/clinical forms. LPGs from three strains (GV02, BA276, and LV79) had higher pro‐inflammatory profiles for most of the mediators, including tumor necrosis factor alpha and interleukin 6. For this reason, glycoconjugates from all strains were biochemically characterized and had polymorphisms in their repeat units. They consisted of three types: type I, repeat units devoid of side chains; type II, containing galactosylated side chains; and type III, containing glucosylated side chains. No relationship was observed between LPG type and the pro‐inflammatory properties. Finally, to evaluate the susceptibility against antileishmanial agents, two strains with high (GV02, BA276) and one with low (BA336) pro‐inflammatory activity were selected for chemotherapeutic tests in THP‐1 cells. All analyzed strains were susceptible to amphotericin B (AmB) but displayed various responses against miltefosine (MIL) and glucantime (GLU). The GV02 strain (canine visceral leishmaniasis) had the highest IC50 for MIL (3.34 μM), whereas diffuse leishmaniasis strains (BA276 and BA336) had a higher IC50 for GLU (6.87–12.19 mM). The highest IC50 against MIL shown by the GV02 strain has an impact on clinical management. Miltefosine is the only drug approved for dog treatment in Brazil. Further studies into drug susceptibility of L. amazonensis strains are warranted, especially in areas where dog infection by this species overlaps with those caused by Leishmania infantum.Item Leishmania infantum-derived lipophosphoglycan as an antigen in the accurate serodiagnosis of canine leishmaniasis.(2019) Portela, Ricardo Wagner Dias; Soares, Rodrigo Pedro Pinto; Porfírio Passos, Gabriela; Larangeira, Daniela Farias; Barral, Thiago Assis Doria; Sampaio, Julia Ramos; Bernardo, Marcos; Sobrinho, Edneia Venâncio Alves; Bahia, Maria Terezinha; Pinho, Flaviane Alves; Melo, Stella Maria BarrouinLipophosphoglycan (LPG) is the major surface glycoconjugate of Leishmania protozoan and has an important biological role in host-parasite interactions both in the midgut epithelium of the sand fly vector and in the vertebrate macrophages. Canine leishmaniasis (CanL) is a chronic infectious disease predominantly caused by Leishmania infantum. An early and accurate immunodiagnosis of the disease is crucial for veterinary clinical practice and for disease control. In this work, we evaluated L. infantum LPG as an antigen in an indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for CanL immunodiagnosis (LPG-ELISA) by testing serum samples from 97 naturally infected dogs with diverse clinical presentations ranging from subclinical infection to severe disease, as evaluated by veterinarian infectologists. Serum samples from healthy dogs from non-endemic areas (n = 68) and from dogs with other infectious diseases (n = 64) were used as controls for assay validation. The performance of the LPG-ELISA was compared with that of an ELISA using the soluble fraction of L. infantum total lysate antigen (TLA). LPG-ELISA presented a superior performance in comparison to TLA-ELISA, with 91.5% sensitivity, 98.5% specificity and 99.7% accuracy. A distinguishing feature of the LPG-ELISA compared to the TLA-ELISA was its higher ability to identify subclinical infection in clinically healthy dogs, in addition to the absence of cross-reactivity with other canine infectious diseases. Finally, LPG-ELISA was compared to TR DPP visceral canine leishmaniasis test, the immunochromatographic test recommended by the Brazilian Ministry of Agriculture. LPG-ELISA exhibited higher values of specificity (98.5% versus 93.1%) and sensitivity (91.5% versus 90.6%) compared to TR DPP. In conclusion, L. infantum-derived LPG was recognized by antibodies elicited during CanL in different infection stages and was shown to be a suitable antigen for specific clinical settings of veterinary diagnosis and for public health usage.