Navegando por Autor "Reis, Alexandre Barbosa"
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Item Alterações eritropoéticas e leucopoéticas na Leishmaniose visceral canina.(Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto., 2008) Abreu, Raquel Trópia de; Reis, Alexandre BarbosaA medula óssea é considerada um importante reservatório de parasitos em cães infectados por Leishmania chagasi. Poucos trabalhos na literatura relatam o processo da gênese celular na medula óssea na Leishmaniose Visceral Canina (LVC) em diferentes fomas clínicas. Nesse contexto, o objetivo do presente estudo foi avaliar as alterações na leucopoese e eritropoese bem como investigar a carga parasitária em aspirados de medula óssea de cães naturalmente infectados por L. chagasi apresentando diferentes formas clínicas e padrões distintos de densidade parasitária na medula óssea. Dessa forma, filmes de medula óssea corados por Giemsa foram avaliados considerando três grupos clínicos: assintomático (CA, n=50), oligossintomático (CO, n=44) e sintomático (CS, n=65) comparados com cães não-infectados (CNI, n=28). A densidade parasitária foi avaliada na medula óssea e os resultados expressos como “Leishman Donovan Units” (LDU), e classificados em tercis como baixo (BP, n=51), médio (MP, n=51) ou alto (AP, n=48) parasitismo. Em um segundo grupo de 48 cães (CA, n=10; CO, n= 9; CS, n= 12; CNI, n= 17) o mielograma e hemograma completo foram realizados para investigar a associação entre a celularidade da medula óssea e do sangue periférico. Os resultados obtidos indicaram diferenças significativas em relação à eritropoese considerando proeritroblastos, eritroblastos basófilos, policromáticos e ortocromáticos resultando em hipoplasia eritróide principalmente nos grupos CA e CS. A leucopoese apresentou algumas alterações em cães infectados. Por exemplo, células da linhagem eosinofílica mostraram uma diminuição significativa nos diferentes grupos clínicos comparado com o grupo CNI. Entretanto, células da linhagem neutrofílica mostraram alterações nos diferentes grupos clínicos, tais como um aumento significativo nos diferentes grupos clínicos. Em relação às células mononucleares, foi observado aumento de linfócitos nos grupos CO e CS quando comparado com o grupo CNI. Resultados similares foram encontrados em plasmócitos mostrando clara tendência ao aumento gradual de acordo com a gravidade da infecção. Por outro lado, monócitos tiveram significativo aumento no grupo CO comparado ao grupo CA. A contagem diferencial de células da medula óssea demonstrou um aumento na razão mielóide: eritróide (M:E) devido ao aumento de células granulocíticas nos diferentes grupos clínicos comparado com o grupo CNI. A avaliação parasitológica mostrou maiores índices de LDU em CS comparado com CA. Além disso, os dados demonstraram uma correlação positiva entre status clínico (CA,CO,CS) e densidade parasitária (BP,MP,AP). A avaliação do impacto do parasitismo na medula óssea mostrou resultados similares quando se avaliou os cães classificados em diferentes formas clínicas, tais como, hipoplasia eritróide, hipoplasia eosinofílica, proliferação de células precursoras neutrofílicas, um significativo aumento no número de linfócitos e plasmócitos, destacando o grupo de cães com alto parasitismo com resultados mais significativos. Os resultados do grupo 2 mostraram que as alterações do sangue periférico foram relacionadas às alterações da medula óssea principalmente no grupo CS. De forma interessante, o grupo CS demonstrou diminuição de células da linhagem eritropoética e eritrócitos, hemoglobina e hematócrito caracterizando anemia periférica não-regenerativa. Além disso, foram observados aumento de neutrófilos e seus precursores, diminuição de bastonetes e segmentados eosinófilos e significativo aumento de linfócitos na medula óssea associada à leucopenia com desvio à esquerda, eosinopenia, linfopenia e monocitopenia no sangue periférico. O presente estudo mostrou que a evolução clínica da LVC em cães naturalmente infectados promove claras alterações na medula óssea e no sangue periférico. A progressão da doença da forma clínica assintomática para sintomática foi acompanhada de parasitismo intenso na medula óssea. Assim, os dados analisados em conjunto permitem concluir que a avaliação desses parâmetros constitui uma ferramenta adicional bastante útil no prognóstico da leishmaniose visceral canina, bem como no diagnóstico em duas situações específicas, a saber: a) esclarecer casos com forte suspeita de LVC, porém não confirmados por sorologia, utilizando-se do mielograma; e b) orientar exames complementares para elucidar suspeita de LVC, a partir de dados clínicos e do hemograma.Item An antigenic domain within a catalytically active leishmania infantum nucleoside triphosphate diphosphohydrolase (NTPDase 1) is a target of inhibitory antibodies.(2013) Maia, Ana Carolina Ribeiro Gomes; Porcino, Gabriane Nascimento; Detoni, Michelle de Lima; Emídio, Nayara Braga; Marconato, Danielle Gomes; Pinto, Priscila de Faria; Fessel, Melissa Regina; Reis, Alexandre Barbosa; Juliano Neto, Luiz; Juliano, Maria Aparecida; Marques, Marcos José; Vasconcelos, Eveline GomesWeidentified a shared B domainwithin nucleoside triphosphate diphosphohydrolases (NTPDases) of plants and parasites. Now, an NTPDase activity not affected by inhibitors of adenylate kinase and ATPases was detected in Leishmania infantum promastigotes. By non-denaturing gel electrophoresis of detergent-homogenized promastigote preparation, an active band hydrolyzing nucleosides di- and triphosphate was visualized and, following SDS-PAGE and silver staining was identified as a single polypeptide of 50 kDa. By Western blots, it was recognized by immune sera raised against potato apyrase (SA), r-pot B domain (SB), a recombinant polypeptide derived fromthe potato apyrase, and LbB1LJ (SC) or LbB2LJ (SD), synthetic peptides derived fromthe Leishmania NTPDase 1, and by serum samples from dogs with visceral leishmaniasis, identifying the antigenic L. infantum NTPDase 1 and, also, its conserved B domain (r83–122). By immunoprecipitation assays andWestern blots, immune sera SA and SB identified the catalytically active NTPDase 1 in promastigote preparation. In addition, the immune sera SB (44%) and SC or SD (87–99%) inhibited its activity, suggesting a direct effect on the B domain. By ELISA, 37%, 45% or 50% of 38 infected dogs were seropositive for r-pot B domain, LbB1LJ and LbB2LJ, respectively, confirming the B domain antigenicity.Item An assessment on epitope prediction methods for protozoa genomes.(2012) Resende, Daniela de Melo; Rezende, Antonio Mauro; Oliveira, Nesley Jesus Daher de; Batista, Izabella Cristina Andrade; Oliveira, Rodrigo Corrêa de; Reis, Alexandre Barbosa; Ruiz, Jeronimo ConceiçãoBackground: Epitope prediction using computational methods represents one of the most promising approaches to vaccine development. Reduction of time, cost, and the availability of completely sequenced genomes are key points and highly motivating regarding the use of reverse vaccinology. Parasites of genus Leishmania are widely spread and they are the etiologic agents of leishmaniasis. Currently, there is no efficient vaccine against this pathogen and the drug treatment is highly toxic. The lack of sufficiently large datasets of experimentally validated parasites epitopes represents a serious limitation, especially for trypanomatids genomes. In this work we highlight the predictive performances of several algorithms that were evaluated through the development of a MySQL database built with the purpose of: a) evaluating individual algorithms prediction performances and their combination for CD8+ T cell epitopes, B-cell epitopes and subcellular localization by means of AUC (Area Under Curve) performance and a threshold dependent method that employs a confusion matrix; b) integrating data from experimentally validated and in silico predicted epitopes; and c) integrating the subcellular localization predictions and experimental data. NetCTL, NetMHC, BepiPred, BCPred12, and AAP12 algorithms were used for in silico epitope prediction and WoLF PSORT, Sigcleave and TargetP for in silico subcellular localization prediction against trypanosomatid genomes. Results: A database-driven epitope prediction method was developed with built-in functions that were capable of: a) removing experimental data redundancy; b) parsing algorithms predictions and storage experimental validated and predict data; and c) evaluating algorithm performances. Results show that a better performance is achieved when the combined prediction is considered. This is particularly true for B cell epitope predictors, where the combined prediction of AAP12 and BCPred12 reached an AUC value of 0.77. For T CD8+ epitope predictors, the combined prediction of NetCTL and NetMHC reached an AUC value of 0.64. Finally, regarding the subcellular localization prediction, the best performance is achieved when the combined prediction of Sigcleave, TargetP and WoLF PSORT is used. Conclusions: Our study indicates that the combination of B cells epitope predictors is the best tool for predicting epitopes on protozoan parasites proteins. Regarding subcellular localization, the best result was obtained when the three algorithms predictions were combined. The developed pipeline is available upon request to authors.Item Analysis of the cytokine profile in spleen cells from dogs naturally infected by Leishmania chagasi.(2007) Lage, Ramon Silva; Oliveira, Guilherme Corrêa de; Busek, Solange Cristina Uber; Guerra, Luanda Liboreiro; Giunchetti, Rodolfo Cordeiro; Oliveira, Rodrigo Corrêa de; Reis, Alexandre BarbosaRecent studies suggest that asymptomatic dogs infected with canine visceral leishmaniasis (CVL) develop a Th1 immunological profile whilst oligosymptomatic and symptomatic CVL-infected animals present a Th2 profile. In the present study, an RT-PCR method has been standardised and employed to evaluate the frequency and the semi-quantitative level of expression of the cytokines IL-4, IL-10, IL-12, INF- g and TNF- a in splenocytes of 30 dogs naturally infected with Leishmania chagasiand of 7 non-infected dogs (NID). An increase in the level of expression of IL-12 ( p = 0.059) was detected in all CVL-infected dogs compared with NID. In dogs exhibiting high parasitism, the frequency of expression of IL-10 was higher ( p = 0.011) than in animals presenting low parasitism or medium parasitism (MP) and in NID animals, whilst the level of expression of IL-10 was higher (p = 0.0094) than in animals exhibiting MP and in the NID group. Positive correlations between the levels of expression of IL-10 with respect to the progression of the disease (IL-10: r = 0.3510; p = 0.0337) and the levels of expression of IL-10 and INF- g increase in parasitism (IL-10: r = 0.3428; p = 0.0438 and INF- g: r = 0.4690; p = 0.0045) were observed. Such data suggest that CVL is marked by a balanced production of Th1 and Th2 cytokines, with a predominant accumulation of IL-10 as a consequence of an increase in parasitic load and progression of the disease, and INF- g was related with the increase in parasitic load.Item Analysis using canine peripheral blood for establishing in vitro conditions for monocyte differentiation into macrophages for Leishmania chagasi infection and T-cell subset purification.(2013) Viana, Kelvinson Fernandes; Soares, Rodrigo Dian de Oliveira Aguiar; Roatt, Bruno Mendes; Resende, Lucilene Aparecida; Lemos, Denise da Silveira; Oliveira, Rodrigo Corrêa de; Martins Filho, Olindo Assis; Moura, Sandra Aparecida Lima de; Zanini, Marcos Santos; Araújo, Márcio Sobreira Silva; Reis, Alexandre Barbosa; Giunchetti, Rodolfo CordeiroCanine visceral leishmaniasis (CVL) is a parasitic disease endemic in many countries, anddogs present as the major natural reservoir of the parasite, Leishmania chagasi (syn. L.infantum). Biomarkers in the canine immune system is an important technique in thecourse of developing vaccines and treatment strategies against CVL. New methodologiesfor studying the immune response of dogs during Leishmania infection and after receivingvaccines and treatments against CVL would be useful. In this context, we used peripheralblood mononuclear cells (PBMCs) from healthy dogs to evaluate procedures related to (i)establishment of in vitro conditions of monocytes differentiated into macrophages infectedwith L. chagasi and (ii) purification procedures of T-cell subsets (CD4+and CD8+) usingmicrobeads. Our data demonstrated that after 5 days of differentiation, macrophages wereable to induce significant phagocytic and microbicidal activity after L. chagasi infectionand also showed increased frequency of parasitism and a higher parasite load. Although N-acetyl- _-d-glucosaminidase (NAG) levels presented similar levels of macrophage cultureand L. chagasi infection, a progressive decrease in myeloperoxidase (MPO) levels was ahallmark over 5 days of culture. High purity levels (>90%) of CD4 and CD8 T cells wereobtained on a magnetic separation column. We concluded that monocytes differentiatedinto macrophages at 5 days and displayed an intermediate frequency of parasitism andparasite load 72 h after L. chagasi infection. Furthermore, the purification system usingcanine T-lymphocyte subsets obtained after 5 days of monocyte differentiation provedefficient for CD4 or CD8 T-cell purification (≥90%). The in vitro analysis using L. chagasi-infected macrophages and purified T cells presented a prospective methodology that couldbe incorporated in CVL vaccine and treatment studies that aim to analyze the microbicidalpotential induced by specific CD4+and/or CD8+T cells.Item Antibodies from dogs with canine visceral leishmaniasis (CVL) recognise two proteins from the saliva of lutzomyia longipalpis.(2007) Bahia, Diana; Gontijo, Nelder de Figueiredo; León, Ileana Rodríguez; Perales, Jonas; Pereira, Marcos Horácio; Oliveira, Guilherme Corrêa de; Oliveira, Rodrigo Corrêa de; Reis, Alexandre BarbosaThe saliva of the sand fly Lutzomyia longipalpis, a major vector of Leishmania, exhibits pharmacological and immunomodulatory activities that may facilitate entry and establishment of parasites into the vertebrate host. Salivary gland components of the sand fly are, therefore, potential candidates in the development of a vaccine against human leishmaniasis. With the objective of identifying sand fly saliva proteins that could be used to immunise animals against canine visceral leishmaniasis, we have evaluated anti-saliva antibody reactivity using serum samples collected from dogs naturally infected with Leishmania chagasi. Two proteins with molecular weights of 28.6 and 47.3 kDa were recognised by dog antibodies in Western blot assays. Protein bands were excised from an SDS-PAGE gel and the sequences determined by mass spectrometry. The proteins were identified as LuLo-D7 and Lulo YELLOW, respectively. The significance of these findings in the context of the development of multicomponent vaccination experiments is discussed.Item Antigenicity of a whole parasite vaccine as promising candidate against canine leishmaniasis.(2008) Giunchetti, Rodolfo Cordeiro; Reis, Alexandre Barbosa; Lemos, Denise da Silveira; Martins Filho, Olindo Assis; Oliveira, Rodrigo Corrêa de; Bethony, Jeffrey Michael; Vale, André Macedo; Quetz, Josiane da Silva; Bueno, Lilian Lacerda; Silva, João Carlos França da; Nascimento, Evaldo do; Mayrink, Wilson; Fujiwara, Ricardo ToshioHuman visceral leishmaniasis, one of the most important zoonoses, is caused by the protozoaLeishmania chagasi(syn. L. infantum ) and is present as a fatal disease common in South America and Europe where dogs and wild canids are the main reservoirs. A vaccine against visceral leishmaniasis would be an important tool in the control of this disease in dogs. Although the current strategies for vac-cination against leishmaniasis are based on the use of recombinant antigens, killed vaccines are still attractive in terms of stability of their biochemical composition and antigenicity, cost, and safety. Here we evaluate the immunogenicity of a whole parasite vaccine as a prom-ising candidate against canine leishmaniasis, demonstrated by cellular reactivity, changes in the cellular profile of the peripheral blood and by the differential production of immunoglobulins. Our results showed that immunization elicited mainly a strong cellular reactivity and increase in T-lymphocytes, particularly the subpopulation CD8 + that would be related to the control of tissue parasitism. In addi-tion, a higher production of anti- Leishmania total IgG, characterized by mixed isotypes profile (IgG1 and IgG2), was demonstrated.Item ASP-2/Trans-sialidase chimeric protein induces robust protective immunity in experimental models of chagas’ disease.(2023) Castro, Júlia Teixeira de; Brito, Rory Cristiane Fortes de; Souza, Natália Satchiko Hojo de; Azevedo, Bárbara Ribeiro Batista Vaz de; Castro, Natália Salazar de; Ferreira, Camila Pontes; Giusta, Caroline Junqueira; Fernandes, Ana Paula Salles Moura; Vasconcellos, José Ronnie Carvalho de; Cardoso, Jamille Mirelle de Oliveira; Soares, Rodrigo Dian de Oliveira Aguiar; Vieira, Paula Melo de Abreu; Carneiro, Cláudia Martins; Valiate, Bruno Vinícius Santos; Toledo, Cristiane; Salazar, Andres M.; Caballero, Otávia; Vieira, Joseli Lannes; Teixeira, Santuza Maria Ribeiro; Reis, Alexandre Barbosa; Gazzinelli, Ricardo TostesImmunization with the Amastigote Surface Protein-2 (ASP-2) and Trans-sialidase (TS) antigens either in the form of recombinant protein, encoded in plasmids or human adenovirus 5 (hAd5) confers robust protection against various lineages of Trypanosoma cruzi. Herein we generated a chimeric protein containing the most immunogenic regions for T and B cells from TS and ASP-2 (TRASP) and evaluated its immunogenicity in comparison with our standard protocol of heterologous prime-boost using plasmids and hAd5. Mice immunized with TRASP protein associated to Poly-ICLC (Hiltonol) were highly resistant to challenge with T. cruzi, showing a large decrease in tissue parasitism, parasitemia and no lethality. This protection lasted for at least 3 months after the last boost of immunization, being equivalent to the protection induced by DNA/hAd5 protocol. TRASP induced high levels of T. cruzispecific antibodies and IFNγ-producing T cells and protection was primarily mediated by CD8+ T cells and IFN-γ. We also evaluated the toxicity, immunogenicity, and efficacy of TRASP and DNA/hAd5 formulations in dogs. Mild collateral effects were detected at the site of vaccine inoculation. While the chimeric protein associated with Poly-ICLC induced high levels of antibodies and CD4+ T cell responses, the DNA/hAd5 induced no antibodies, but a strong CD8+ T cell response. Immunization with either vaccine protected dogs against challenge with T. cruzi. Despite the similar efficacy, we conclude that moving ahead with TRASP together with Hiltonol is advantageous over the DNA/hAd5 vaccine due to pre-existing immunity to the adenovirus vector, as well as the cost-benefit for development and large-scale production.Item Aspectos epidemiológicos da leishmaniose visceral canina no Município de Ouro Preto Minas Gerais Brasil.(2019) Rocha, Ana Maria Sampaio; Coelho, George Luiz Lins Machado; Dias, Edelberto Santos; Reis, Alexandre Barbosa; Souza, Carina Margonari de; Andrade, Hélida Monteiro de; Vital, Wendel Coura; Coelho, George Luiz Lins MachadoAs leishmanioses são um grupo de doenças parasitárias de caráter crônico, que apresentam ampla distribuição geográfica, diversidade de agentes etiológicos, podendo acometer seres humanos e animais. A Leishmaniose Visceral (LV) é a forma mais grave dessa infecção e sua transmissão vem se expandindo para as áreas urbanas. Nessa nova dinâmica de transmissão, o cão tem sido considerado o principal reservatório doméstico. Programas de controle propõem a incorporação de áreas de transmissão esporádica nas ações de vigilância, visando evitar e minimizar a propagação da doença. A proximidade com área endêmica e o não registro de investigação sistemática sobre a LV,fez com que o município de Ouro Preto fosse tratado como se essa infecção não fosse prevalente. O objetivo desse trabalho foi determinar os aspectos epidemiológicos da leishmaniose visceral canina no município de Ouro Preto, Minas Gerais. O estudo foi do tipo transversal amostral (n=726), realizado nos 13 distritos de Ouro Preto e em três localidades. A coleta das amostras caninas foi realizada no ano 2016, tendo como população-alvo os cães domiciliados participantes da campanha de vacinação antirrábica. O material avaliado destes animais foi o soro e o sangue total, coletados por punção venosa. O diagnóstico da infecção por LV foi realizado pelo método ELISA (Kit UFMG), ELISA (Kit Bio-Manguinhos), DPP® e qPCR-kDNA. O estudo entomológico ocorreu durante um ano hidrológico, correlacionando densidade vetorial aos fatores climáticos e à altitude. De modo geral, o inquérito amostral superou a frequência esperada de cães avaliados. A definição da infecção canina por LV por diferentes métodos diagnósticos permitiu observar a baixa concordância dos métodos sorológicos com o método molecular. Assumindo este como referência, o método ELISA (kit Bio-maguinhos) apresentou 37,5% e 62,2% de sensibilidade e especificidade, respectivamente. O mesmo método, porém de fabricante diferente (kit-UFMG), obteve o menor resultado de sensibilidade (19,4%) e a maior especificidade (95,8%). O método imunocromatográfico DPP® também revelou comportamento similar, baixa sensibilidade (50%) e moderada especificidade (87,9%). Os valores do Kappa não ultrapassaram 36,8%. A prevalência da LVC no município de Ouro Preto, considerando a concordância dos métodos sorológicos DPP® e ELISA (Bio-manguinhos), foi de 1,93%. No entanto, considerando o diagnóstico molecular (qPCR-kDNA) a prevalência da infecção foi de 20,0%. A espécie responsável pela infecção dos cães foi a Leishmania infantum. A prevalência da LVC variou significativamente entre as áreas avaliadas e o principal vetor da doença, Lutzomyia longipalpis, foi encontrado em dois distritos do município. Dessa forma, a existência de animais infectados e de vetores é um alerta para o risco de transmissão da doença nessa região.Item Association between mast cells, tissue remodelation and parasite burden in the skin of dogs with visceral leishmaniasis.(2017) Cardoso, Jamille Mirelle de Oliveira; Ker, Henrique Gama; Soares, Rodrigo Dian de Oliveira Aguiar; Moreira, Nádia das Dores; Mathias, Fernando Augusto Siqueira; Reis, Levi Eduardo Soares; Roatt, Bruno Mendes; Vieira, Paula Melo de Abreu; Vital, Wendel Coura; Carneiro, Cláudia Martins; Reis, Alexandre BarbosaCanine visceral leishmaniosis (CVL) is a zoonosis of major public health impact caused by organisms of the genus Leishmania which is transmitted to human and animals by phlebotomine sand flies. The skin is the first point of contact with Leishmania parasites for sandy fly vectors and it is considered an important reservoir compartment in infected dogs. The aim of this study was to determine the main histophatologic alterations in ear skin of dogs naturally infected by Leishmania infantum with different clinical status and different degrees of parasitism. Therefore, thirty-four dogs naturally infected with L. infantum were grouped according to their clinical status in asymptomatic (AD, n =11), oligosymptomatic (OD, n=11) and symptomatic dogs (SD, n=12) as well as their degrees of parasite load in the skin as low (LP, n=11), median (MP, n= 11) and high (HP, n=12) parasitism. Additionally, ten dogs were used as control (CD, n =10). At necropsy, skin samples were collected for further histological and parasitological analysis. The OD and SD groups presented higher parasite burden than AD group. The inflammation was higher in SD group when compared to OD and AD. The LP, MP and HP groups showed an increasing inflammatory process, indicating that a great parasite load is accompanied by a major inflammatory process in the skin. The number of mast cells was higher in the OD and LP groups than CD group, suggesting that these cells may be involved in tissue remodeling, since that an increase of type III collagen fibers and decrease type I collagen fibers were observed in these groups. Taken together, our results enable a better understanding of the alterations in skin of CVL dogs and consequently new insights about the pathogenesis of CVL.Item Autochthonous canine visceral leishmaniasis in a non-endemic area : Bom Sucesso, Minas Gerais State, Brazil.(2008) Silva, Marcio Roberto; Marques, Marcos José; Romanha, Alvaro José; Santa Rosa, Idael Christiano de Almeida; Carneiro, Cláudia Martins; Reis, Alexandre BarbosaO presente trabalho descreve inicialmente um cão com sintomas característicos de leishmaniose visceral. Amostra de soro desse cão foi positiva por imunofluorescência indireta (IFI) conduzida no IgG total anti- Leishmania em 1999. Além disso, tecidos desse cão foram positivos por reação em cadeia pela polimerase (PCR) conduzida em 2004, identificando DNA de Leishmania no cerebelo, fígado, rim e intestino. Esta é a primeira vez que um cão com leishmaniose visceral autóctone foi descrito no Município de Bom Sucesso, Minas Gerais, Brasil. O achado desse cão reagente à IFI levou a uma investigação epidemiológica nesse município. Essa investigação foi conduzida de março de 1999 a dezembro de 2005. Vinte e dois de um total de 734 (3%) cães examinados foram reagentes à IFI. Entre os 22 cães IFI reagentes, seis apresentaram sintomas característicos de leishmaniose visceral canina. Os resultados desta investigação epidemiológica foram enviados às autoridades locais e estaduais de saúde pública requerendo medidas preventivas e de controle para leishmaniose visceral de forma a interromper a transmissão da doença e evitar a ocorrência de casos humanos.Item Avaliação da atividade anti-Trypanosoma cruzi in vitro e in vivo da miltefosina em combinação com compostos nitro-heterocíclicos e com derivados azólicos.(2019) Mota, Suianne Letícia Antunes; Bahia, Maria Terezinha; Bahia, Maria Terezinha; Reis, Alexandre Barbosa; Diniz, Lívia de Figueiredo; Soeiro, Maria de Nazaré Correia; Mosqueira, Vanessa Carla FurtadoA terapia combinada e o reposicionamento de fármacos ganharam atenção como uma possível estratégia para superar as deficiências do atual arsenal terapêutico para a doença de Chagas. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito anti-Trypanosoma cruzi da miltefosina em associação com compostos nitroheterocíclicos (benznidazol e metabólito sulfona do fexinidazol) e com derivados azólicos (posaconazol e ravuconazol). Para evitar efeitos tóxicos a citotoxicidade dos compostos (isolados ou combinados) para as linhagens celulares H9c2 e J774 foi avaliada. Não foi observada citotoxicidade destes compostos para as células hospedeiras nas concentrações próximas ao IC90 de cada fármaco isolado ou em combinação. Em seguida, o efeito in vitro da miltefosina em combinação com compostos nitro- heterocíclicos ou derivados azólicos contra amastigotas das cepas Y e colombiana foi avaliado em um ensaio de 72h, utilizando as mesmas linhagens celulares. Não foi observada uma marcante influência da cepa do parasito nos valores de IC50 ou IC90 para miltefosina e para os compostos nitro-heterocíclicos, sendo o valor de IC50 no máximo 3,4 vezes maior quando células H9c2 foram infectadas pela cepa colombiana e o IC90 no máximo 2.0 vezes. De forma diferente, os valores de IC50 do ravuzonazol e do posaconazol foram 23 e 11,7 vezes maiores para a cepa colombiana, em relação à cepa Y, respectivamente. Os valores de IC90 foram 4.26 e 7.66 vezes maiores para a cepa colombiana quando as células infectadas foram tratadas com ravuconazol e posaconazol, respectivamente. Os valores de IC50 e IC90 não foram influenciados pela célula hospedeira. As interações foram classificadas como aditivas para todas as combinações de drogas avaliadas (somas das concentrações inibitórias fracionárias - ∑ICF> 0,5). No entanto, é importante notar que os valores de ΣFIC para as combinações miltefosina/compostos nitro-heterocíclicos foram sempre <1,0. Diferentemente, os resultados de ΣFIC>1 foram observados na maioria dos experimentos realizados com miltefosina/derivados azólicos. Não foi observada a influência da cepa do parasito ou da célula hospedeira no tipo de interação entre os diferentes compostos. Em seguida, camundongos infectados pela cepa Y foram tratados com 10 doses de 40 mg/kg de miltefosina administradas em dias consecutivos ou alternados e com 20 doses de 50 e 100mg/kg de benznidazol administradas em dias consecutivos. Os fármacos foram administrados em monoterapia e em combinação nas mesmas doses. O tratamento com miltefosina e benznidazol a 50mg/kg em monoterapia levaram à supressão transitória da parasitemia. Os mesmos resultados podem ser observados entre animais tratados com 40mg/kg de miltefosina (dias consecutivos) em combinação com 50mg/kg de benznidazol. No entanto, o tratamento com a mesma dose de miltefosina, administrada em dias alternados, e 50mg/kg de benznidazol foi capaz de curar 62,5% dos animais. A administração de uma dose mais elevada de benznidazol (100mg/kg) e 40mg/kg de miltefosina aumenta significativamente a taxa de cura: 87,5% entre camundongos tratados com miltefosina em dias consecutivos e 100% naqueles que receberam o fármaco em dias em dias alternados. Estes resultados mostram uma interação positiva entre a miltefosina e o benznidazol. No entanto é necessário a avaliação da sua eficácia contra a infecção induzida por outras cepas do parasito, bem como no tratamento da fase crônica da infecção.Item Avaliação da dose-resposta e da associação de adjuvantes na potência de vacinas quiméricas contra leishmaniose visceral : estudo de fase I em camundongos BALB/c.(2020) Ostolin, Thais Lopes Valentim Di Paschoale; Reis, Alexandre Barbosa; Brito, Rory Cristiane Fortes de; Reis, Alexandre Barbosa; Brito, Rory Cristiane Fortes de; Fujiwara, Ricardo Toshio; Borges, William de CastroNo Brasil, a leishmaniose visceral canina (LVC) encontra-se em expansão sendo um sério problema de saúde pública. A alta prevalência de cães infectados reforça a necessidade de uma vacina para ser empregada em campanhas de vacinação de forma profilática. Nesse trabalho foram avaliadas duas quimeras desenhadas a partir do mapeamento de epítopos de células T pertencentes a proteínas de Leishmania infantum descritas na literatura como candidatas vacinais. O objetivo do estudo foi avaliar a dose-resposta e o efeito da associação de adjuvantes na eficácia de vacinas quiméricas contra a leishmaniose visceral em camundongos BALB/c. Os animais foram divididos em 14 grupos Salina, Saponina e Monofosforil lipídio A (SM) e quimeras A e B, nas doses de 5, 10 e 20 g, associados ou não aos adjuvantes. Esses foram imunizados com 3 doses, com intervalo de 15 dias entre as doses, e desafiados com 1x107 promastigotas de L. infantum. Foi avaliada a atividade proliferativa de linfócitos T totais (CD3+ ) e suas subpopulações (CD3+CD4+ e CD3+CD8+ ) e a produção de citocinas intracitoplasmáticas (IL-2, IFN-, TNF-, IL-4 e IL-10) após estímulo com antígeno solúvel de L. infantum (ASLi) por citometria de fluxo. Além disso, foi determinada a produção de óxido nítrico (NO) em sobrenadante de cultura de esplenócitos estimulados com ASLi e produção de imunoglobulinas murinas anti-Leishmania (IgG total, IgG1 e IgG2) no soro dos camundongos por ELISA. A quantificação da carga parasitária foi feita no baço por PCR em tempo real (qPCR). Ambas quimeras nas três doses avaliadas, apresentaram aumento da proliferação de linfócitos T e suas subpopulações quando comparadas ao grupo Salina. Quando associadas aos adjuvantes, o mesmo comportamento foi observado sendo o aumento em comparação aos grupos Salina e SM. Observou-se aumento de células T CD4+ e CD8+ produtoras de IFN-, TNF- e IL-2, enquanto houve redução de IL-4 e IL-10, tanto em A quanto em B nas três doses. Cabe ressaltar, que em B na dose de 5 g associada a SM houve aumento na produção de IFN- e IL-2 e redução de IL-4 e IL-10 pelos linfócitos TCD4+ em comparação ao grupo Salina. Os resultados da reatividade anti-Leishmania, mostraram que as proteínas quiméricas A e B aumentaram a produção de IgG total e IgG2 nas três doses avaliadas. Quando associadas a SM, apenas a proteína quimérica A, mostrou-se reativa. Em relação ao subclasse IgG1, houve aumento nas doses de 5 g e 10 g. E para IgG2 houve diferença significativa das doses de 5 e 10 g com a dose de 20 g. Quando quantificamos a carga parasitária foi observado que as proteínas quiméricas sozinhas não foram capazes de reduzir a carga no baço dos animais. Em contrapartida, quando foram associadas ao sistema SM, houve redução da carga parasitária no baço em todas as doses avaliadas para ambas quimeras. Observou-se aumento na produção de NO em todos grupos que foram imunizados com as quimeras associadas ao sistema SM. Os resultados obtidos foram promissores, demonstrando que mesmo em doses reduzidas as quimeras foram capazes de desencadear uma resposta imunológica satisfatória. Os resultados mostram que as duas quimeras sozinhas e ou associadas ao sistema de adjuvantes foram imunogênicas mesmo em doses reduzidas. Além disso, esse estudo contribuirá para o desenvolvimento de novas vacinas contra a LV.Item Avaliação da imunogenicidade de dois novos Imunobiológicos candidatos a vacina contra Leishmaniose visceral canina.(Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto., 2007) Giunchetti, Rodolfo Cordeiro; Reis, Alexandre BarbosaConsiderando a importância de estratégias imunoprofiláticas para o controle da leishmaniose visceral, a inexistência de drogas capazes de curar cães infectados e o aumento de casos de resistência aos antimoniais pentavalentes, o presente trabalho buscou avaliar a imunogenicidade de dois novos imunobiológicos candidatos a vacina contra leishmaniose visceral canina (LVC). Observa-se uma lacuna em estudos que buscam avaliar a imunogenicidade pós-vacinal de imunobiológicos anti-LVC. Assim, o presente estudo propôs uma análise detalhada da imunogenicidade considerando diversos biomarcadores da resposta imune celular e humoral após as três doses das diferentes estratégias vacinais. Trinta e cinco cães sem raça definida foram subdivididos em sete grupos experimentais, entre os quais: (i) grupo controle C (n = 10) que recebeu 1 mL de salina estéril a 0,9%; (ii) grupo LB (n = 5) que recebeu 600 μg de proteína de Leishmania braziliensis em 1 mL de salina estéril a 0,9%; (iii) grupo Sap (n = 5) que recebeu 1 mg de saponina em 1 mL de salina estéril a 0,9%; (iv) grupo LBSap (n = 5) que recebeu 600 μg de proteína de L. braziliensis associado a 1 mg de saponina em 1 mL de salina estéril a 0,9%; (v) grupo Sal (n = 5) que recebeu extrato de glândula salivar de Lutzomyia longipalpis (SGE) equivalente ao conteúdo de 5 ácinos da glândula salivar em 1 mL de salina estéril a 0,9%; (vi) grupo LBSal (n = 5) que recebeu 600 μg de promastigotas de L. braziliensis associado ao SGE em 1 mL de salina estéril a 0,9%; (vii) grupo LBSapSal (n = 5) que recebeu 600 μg de promastigotas de L. braziliensis associado a 1 mg de saponina e ao SGE em 1 mL de salina estéril a 0,9%. Cada animal recebeu três aplicações subcutâneas no flanco esquerdo em intervalos de quatro semanas. Os resultados indicam que a saponina quando presente (Sap, LBSap, LBSapSal) induziu em alguns cães a formação de edema ou de pequeno nódulo local, sem apresentar lesões ulceradas ou outras alterações adversas. A avaliação da inocuidade e toxicidade das diferentes vacinas não revelou contra-indicações para utilização. A avaliação da resposta humoral revelou que os grupos LBSap e LBSapSal apresentaram aumento dos níveis de IgG total, IgG1 e IgG2 anti-Leishmania, sugerindo um perfil de resposta imune misto Th1/Th2. De forma semelhante, no grupo LBSapSal foi observado aumento dos níveis de IgG total, IgG1 e IgG2 anti-SGE, que tem sido previamente relacionado ao estabelecimento de uma resposta imune protetora anti- Leishmania. Além disto, experimentos utilizando Western blot para avaliar a reatividade de anticorpos caninos anti-proteínas do SGE evidenciaram o predomínio de proteínas com peso molecular de 35, 45 e 75 KDa, particularmente no grupo LBSapSal, sendo relacionado a um padrão de resistência contra infecção por Leishmania. A avaliação da resposta celular contou com o estudo imunofenotípico de células mononucleares do sangue periférico (PBMC) e revelou aumento do número de linfócitos B CD21+, linfócitos T CD5+ e das subpopulações T (CD4+ e T CD8+), indicando o estabelecimento de imunidade protetora contra infecção por Leishmania como previamente relatado na LVC. Além disto, foi observada pela análise in vitro redução do índice de proliferação utilizando VSA (vaccine soluble antigen) ou SLcA (soluble Leishmania chagasi antigen) nos grupos LB e Sal, enquanto os grupos LBSap e LBSapSal apresentaram aumento da atividade linfoproliferativa na presença de ambos os estímulos. De forma interessante, foi demonstrado no grupo Sal correlação negativa entre a atividade linfoproliferativa e linfócitos T CD4+ ou monócitos CD14+. Estes resultados permitem especular que a imunização realizada no grupo Sal poderia inibir a atividade de monócitos CD14+ em ativar linfócitos T CD4+ e assim reduzir a atividade linfoproliferativa. Por outro lado, PBMC cultivados in vitro com SLcA do grupo LBSap e com VSA ou SLcA no grupo LBSapSal apresentaram aumento da atividade XI linfoproliferativa acompanhada pela indução de linfócitos T CD8+ antígeno-específicos. Estes resultados sustentam a hipótese de que a vacinação com LBSap e LBSapSal estimularia o desenvolvimento de mecanismos imunoprotetores relacionados ao controle do parasitismo por Leishmania considerando a indução de linfócitos T CD8+ antígeno-específicos para proteínas relacionadas ao agente etiológico da LVC. A avaliação de potenciais células apresentadoras de antígenos (APC) revelou aumento do número de monócitos CD14+ circulantes nos grupos LBSap e LBSapSal. Além disto, altas contagens de APC foram associadas ao aumento da expressão de linfócitos MHC-I no grupo LBSap e de linfócitos CD80 e MHC-I no grupo LBSapSal, sugerindo que esta associação poderia representar a interação entre as respostas imunes inata e adaptativa, refletindo no aumento do perfil de ativação durante as imunizações. Os resultados obtidos pelas análises dos níveis de óxido nítrico (NO) pela avaliação dos níveis de nitrito no sobrenadante de cultura estimuladas com SLcA no grupo LBSap e no soro do grupo LBSapSal confirmam a hipótese de que estas vacinas induzem um perfil associado a resistência contra a infecção por Leishmania. Os resultados obtidos neste trabalho indicam que o potencial imunoprotetor induzido pelas vacinas LBSap e LBSapSal são compatíveis com o controle do agente etiológico da LVC.Item Avaliação de parâmetros parasitológicos e imunológicos no baço, fígado e em células derivadas de leucócitos circulantes, em cães naturalmente infectados por Leishmania infantum, assintomáticos ou sintomáticos.(2017) Vieira, João Filipe Pereira; Reis, Alexandre Barbosa; Carneiro, Cláudia Martins; Soares, Rodrigo Dian de Oliveira Aguiar; Reis, Alexandre Barbosa; Carvalho, Andréa Teixeira de; Andrade, Hélida Monteiro de; Lana, Marta de; Borges, William de CastroA Leishmaniose Visceral zoonótica é um problema de saúde pública global com uma expansão crescente em várias regiões do mundo. O cão, como principal reservatório doméstico do parasito, apresenta-se como um dos fatores que favorecem a expansão da doença em humanos. Dois dos principais órgãos afetados pela leishmaniose visceral canina (LVC) são o baço e o fígado, que apresentam alterações estruturais, decorrentes da infecção. A célula mais parasitada no contexto da infecção por L. infantum é o macrófago, sendo também a célula mais importante na eliminação de formas amastigotas, através da produção de óxido nítrico (NO), ou espécies reativas de oxigênio (ROS). Dessa forma, nosso estudo buscou avaliar a influência de determinadas citocinas na produção de mediadores microbicidas por macrófagos do baço, fígado e derivados de monócitos circulantes, assim como, a correlação destes fatores imunológicos, com a forma clínica, a carga parasitária e a esplenomegalia no contexto da leishmaniose visceral canina (LVC). Nossa estratégia experimental contou com 27 cães, divididos entre cães não infectados (CNI - n=7), cães infectados assintomáticos (CA - n=10) e cães infectados sintomáticos (CS - n=9). Nos cães infectados, foi avaliada a carga parasitária por qPCR e LDU (Leishman donovan units), sendo observada uma carga parasitária maior no baço e fígado do grupo CS. Foi ainda avaliada a presença e grau de esplenomegalia, por ultrassonografia, sendo verificado que cães do grupo CS, apresentam um maior grau de esplenomegalia, comparativamente a cães do grupo CNI e CA. Para avaliação da resposta imune no baço e fígado, foi realizada por citometria de fluxo uma avaliação ex vivo destes compartimentos. Os resultados demonstraram que em ambos os órgãos existe uma maior população de linfócitos T CD3+ em cães do grupo CA, comparativamente ao grupo CNI. No fígado foi constatado um menor percentual de linfócitos T CD4+ e um maior percentual de linfócitos T CD8+, no grupo CS, relativamente aos grupos CNI e CA. Ao avaliar a produção intracelular de IFN- e IL-4 nas subpopulações de linfócitos T, foi observado que linfócitos T CD4+ do baço e fígado de cães do grupo CA demonstraram uma maior capacidade de produção de IFN-, em comparação aos do grupo CNI e CS. Seguidamente, foram avaliadas por qPCR as expressões de RNAm de várias citocinas associadas com a resistência e susceptibilidade e da enzima iNOS em baço e fígado, tendo sido constatada uma maior expressão de IL-12 em ambos os órgãos de cães do grupo CA, em relação ao grupo CNI. No compartimento esplênico, foi ainda observado um aumento na expressão de iNOS no grupo CA, por comparação aos grupos CNI e CS e um aumento na expressão de IL-10 nos cães do grupo CS, em relação aos grupos CA e CNI. Ainda nos compartimentos esplênico e hepático, foi avaliada a produção de NO e ROS por macrófagos, tendo sido constatada um aumento na frequência de macrófagos produtores de NO em cães do grupo CA, por comparação aos do grupo CNI. Em relação à produção de ROS, foi observada uma maior produção em macrófagos do grupo CA, em relação ao grupo CNI, em ambos os órgãos. Foram ainda realizadas avaliações imunológicas in vitro, em sistemas de co-cultivo incluindo macrófagos derivados de monócitos circulantes após infecção com promastigotas vivos de L. infantum GFP, em cultivo com subpopulações de linfócitos T autólogos (M + CD4+; M + CD8+; M + CD4+ e CD8+). Partindo desses co-cultivos foi concluído que macrófagos do grupo CA apresentaram uma maior redução da taxa e intensidade de infecção quando em co-cultivo com linfócitos T CD4+ e/ou CD8+, além disso foi observada um maior predomínio de linfócitos T CD4+ produzindo IFN- em detrimento de células produtoras de IL-4 nos cães do grupo CA. Além disso, foi constatado qCA apresentaram um maior percentual de macrófagos produtores de NO quando em co-cultivo com linfócitos T CD4+ e linfócitos T CD4+ e CD8+, quando comparados ao grupo CS. Foi ainda, examinada a possível existência de correlações entre os parâmetros avaliados nas diferentes metodologias. Foi assim observada uma íntima correlação entre fatores, tais como, a expressão de IL-12, o percentual de linfócitos T CD4+ produtores de IFN- e o percentual de macrófagos produtores de NO que estão associados à resistência. Por outro lado, fatores tais como a expressão esplênica de IL-10, a esplenomegalia e o parasitismo, são fatores intimamente associados à susceptibilidade perante a infecção por L. infantum. Estes resultados contribuem para o entendimento da imunopatologia da LVC e permitiram identificar marcadores de resistência e susceptibilidade, num contexto clínico e no desenvolvimento de novas formas de diagnóstico e vacinas.Item Avaliação de uma vacina terapêutica (LBMPL) no tratamento da leishmaniose visceral utilizando o cão naturalmente infectado com Leishmania infantum como modelo experimental.(2013) Roatt, Bruno Mendes; Reis, Alexandre BarbosaA leishmaniose visceral (LV) é uma das doenças mais negligenciadas no mundo, que afeta principalmente os países mais pobres. Epidemias urbanas de LV são observadas em várias cidades do Brasil e a doença tem sido verificada como infecção oportunista em pacientes com AIDS. Estima-se que a infecção HIV/L. infantum aumenta o risco em 100 a 2.320 vezes de se desenvolver uma LV grave. Atualmente, diversos são os relatos do surgimento de cepas resistentes do parasito aos fármacos convencionais. Sendo assim, o desenvolvimento de novas estratégias profiláticas/terapêuticas (imunofármacos) contra a doença se faz necessário e urgente. Neste contexto, muitos modelos animais experimentais já foram avaliados e o cão, se destaca como um dos melhores modelos experimentais para o estudo da LV humana (LVH) bem como seu emprego em ensaios pré-clínicos, pois apresenta características clínico-patológicas e uma história natural de doença extremamente semelhantes à LVH ativa e grave. Dessa forma, nosso estudo buscou avaliar a estratégia de tratamento empregando uma vacina terapêutica composta por antígenos totais de L. braziliensis associada ao adjuvante MPL (vacina LBMPL) para LVH empregando cães sintomáticos, naturalmente infectados por L. infantum. Assim, 16 cães infectados foram subdivididos em dois grupos experimentais: um grupo que recebeu como imunoterapia o adjuvante monofosforil lipídeo A apenas, sendo considerado grupo controle (MPL; n=6) e outro que recebeu como imunoterapia a vacina composta por antígenos de L. braziliensis associada ao adjuvante MPL (LBMPL n=10). Os animais foram submetidos a um esquema imunoterapêutico composto por 3 séries de tratamento, cada série de 10 doses com concentrações crescentes do antígeno vacinal (60μg – 300μg de antígeno protéico + 5μg - 25μg de MPL (dias 1-5) e / 300μg Ag + 25μg MPL (dias 6-10) 1ª série / 300μg Ag + 25μg MPL 2ª e 3ª séries) sob a via subcutânea com intervalo de 10 dias de descanso entre cada série. Os cães foram avaliados antes de serem tratados (T0) e após 15 (T15), 30 (T30) e 90 (T90) dias do tratamento sob os aspectos hemato-bioquímicos, imunológicos, clínicos e parasitológicos. Nossos principais resultados revelaram que a imunoterapia com a vacina LBMPL foi capaz de restabelecer e normalizar as principais alterações hematológicas (eritrócitos, hemoglobina, hematócrito e plaquetas) e bioquímicas (uréia, AST ou TGO, fosfatase alcalina, bilirrubina, e proteína total) decorrentes da LVC e presentes antes do tratamento. Além disso, cães imunotratados com a vacina LBMPL responderam na avaliação ex vivo, com aumento de linfócitos T CD3+ e suas subpopulações (T CD4+ e T CD8+), redução de linfócitos B CD21+, redução na razão T CD4+/T CD8+, aumento da razão LT/LB, aumento de células NK CD5-CD16+ e aumento de monócitos CD14+ circulantes como principais biomarcadores celulares de sucesso terapêutico no sangue periférico. Já no contexto das avaliações in vitro, animais submetidos à vacinoterapia com LBMPL desenvolveram forte memória imunológica antígeno-específica, capaz de induzir elevada atividade linfoproliferativa frente ao estímulo com antígeno solúvel de L. infantum (ASLi) acompanhado por reconhecimento preferencial de células T CD4+ e T CD8+-ASLi específicas. Interessantemente, foi também observado aumento tanto de linfócitos T CD4+IFN-+ e T CD8+IFN-+ bem como redução de linfócitos T CD4+ IL-4+ e T CD8+ IL-4+ após estimulação com ASLi e aumento na produção/secreção de citocinas pró-inflamatórias como TNF- e redução na produção de citocinas imunomodulatórias como IL-10 por células mononucleares do sangue periférico (CMSP); citocina esta, responsável pela imunopatogênese da LV grave. Estes achados caracterizam perfil de resistência a infecção por Leishmania e resposta positiva ao tratamento nos cães imunotratados com a vacina terapêutica LBMPL. De forma surpreendente, em relação aos sinais clínicos sugestivos de LVC, os animais imunotratados com LBMPL apresentaram redução drástica na intensidade e na quantidade de sinais/sintomas clínicos da LV, aumento da massa corporal além de redução da esplenomegalia avaliada clinicamente e por ultrassom, fatores estes intimamente associados ao sucesso terapêutico na doença humana. Somado-se a isso, a vacina LBMPL promoveu ainda uma redução da carga parasitária, avaliada aqui pela PCR em Tempo Real (qPCR), na medula óssea, baço e pele nos cães infectados, sendo até mesmo possível observar em alguns animais ausência de parasitismo nestes órgãos. Os resultados obtidos no presente estudo, confirmam e reafirmam a indicação do cão naturalmente infectado com L. infantum, como modelo experimental pré-clínico de altíssimo valor na leishmaniose visceral. Além disto, nossos resultados permitem também sugerir o uso da imunoterapia com a vacina terapêutica LBMPL como uma potencial proposta de tratamento na leishmaniose visceral canina e/ou humana.Item Avaliação em larga escala do Kit LeishFlow para o diagnóstico sorológico da Leishmaniose Visceral Canina.(2021) Soares, Nathália Caroline; Soares, Rodrigo Dian de Oliveira Aguiar; Reis, Alexandre Barbosa; Soares, Rodrigo Dian de Oliveira Aguiar; Fraga, Deborah Bittencourt Mothé; Carneiro, MariângelaA Leishmaniose Visceral (LV) é uma zoonose que apresenta grande distribuição mundial e integra o grupo de doenças tropicais negligenciadas da Organização Mundial de Saúde. No Brasil, o cão tem um papel importante na disseminação da LV e o diagnóstico preciso da doença canina é essencial para o controle da enfermidade. Atualmente, o protocolo de diagnóstico conta com dois principais testes, o TR-DPP® e EIE-LVC, que apresentam limitações, entre elas se destacam: reações cruzadas com outros patógenos caninos, baixa sensibilidade na detecção de cães assintomáticos e ocorrência de resultados falso-positivos em animais vacinados. Em consequência dessas limitações, há uma falha na rápida identificação de animais nas áreas endêmicas, comprometendo as medidas de controle. Em busca de melhorias no diagnóstico da doença canina, o uso de técnicas mais sensíveis, como a citometria de fluxo é uma opção, pois apresenta um alto desempenho e melhor detecção de animais com baixo título de anticorpos. Nosso grupo de pesquisa desenvolveu nos últimos anos um protótipo de kit, denominado LeishFlow, para o diagnóstico sorológico por citometria de fluxo da Leishmaniose Visceral Canina (LVC). em que obtivemos bons resultados iniciais. Para aprofundarmos e aprimorarmos o desenvolvimento biotecnológico do Kit LeishFlow, neste estudo produzimos e revalidamos um novo lote do Kit, avaliamos o desempenho do novo kit em larga escala e comparamos a eficácia do emprego do LeishFlow como teste único para o diagnóstico da LVC em paralelo aos testes preconizados pelo Ministério da Saúde (MS). Os testes foram realizados em uma ampla variedade de soros caninos (n = 1.546), estes coletados em uma área de alta endemicidade, desta forma, estabelecemos a concordância entre os testes diagnósticos e a prevalência mais realística da doença com um teste de melhor sensibilidade e especificidade. O uso do Kit LeishFlow sozinho resultou em melhora diagnóstica, ao analisarmos a prevalência da área endêmica estudada observamos que o TR-DPP® e EIE-LVC apresentaram um valor de 18,24%, já o LeishFlow apresentou uma prevalência de 29,43%. Nossos resultados mostram que o LeishFlow tem um alto potencial como teste diagnóstico único, e pode descriminar os animais infectados de não infectados para L. infantum, apresentando um valor de sensibilidade (88,3%) e especificidade (83,7%), quando referenciado pelos testes TR-DPP® e EIE-LVC, e uma concordância de 84,5%. Demonstrou bons resultados ao estratificar animais por sintomatologia, nos cálculos de sensibilidade (95,1%), especificidade (72,1%) e acurácia (85%) dos animais sintomáticos e para animais assintomáticos apresentou sensibilidade de 87,1% e especificidade de 84,7%, e acurácia de 82,3% quando utilizados os testes padrão de referência do MS. O LeishFlow, por ser mais sensível e específico, melhoraria a detecção de animais positivos nas áreas endêmicas, e por ser um teste único, diminuiria os custos operacionais, a rapidez no diagnóstico e assim nas ações de controle, o que torna essa metodologia uma alternativa para o diagnóstico sorológico da LVC. Além disso, mais opções de teste de diagnóstico é essencial para laboratórios privados e serviços veterinários no Brasil, dada a crescente demanda e impacto na saúde pública causado pela LVC.Item Avaliação in vitro do potencial leishmanicida de derivados de aldiminas e adutos de Hantzsch.(2016) Salomão, Neyza Emilia de Oliveira; Reis, Alexandre Barbosa; Reis, Alexandre Barbosa; Souza, Gustavo Henrique Bianco de; Marques, Marcos JoséA Leishmaniose Visceral (LV) é a forma mais grave e devastadora da doença, que se não diagnosticada e tratada a tempo leva a óbito. O tratamento convencional da LV é baseado num repertório terapêutico restrito de fármacos como o antimoniato pentavalente e a anfotericina B, que apresentam elevada toxicidade. Dessa forma, o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas e a prospecção de novos fármacos é fundamental para o controle e tratamento da doença. Uma possível alternativa para novos medicamentos são os compostos sintéticos, e neste cenário encontram-se os derivados de aldiminas e adutos de Hantzsch que demonstraram prévia ação antifúngica e leishmanicida. Assim, nesse estudo propusemos testar in vitro a ação leishmanicida destes derivados de aldiminas (n=7) e adutos de Hantzsch (n=5) em diferentes células e por metodologias distintas. Avaliamos a citotoxicidade dos diferentes compostos pelo método colorimétrico de Brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2il)-2,5-difenil tetrazólio (MTT) em macrófagos murino (J774.A1) e canino (DH82) sendo observada uma maior citotoxicidade nos compostos de Aldiminas 3I5 e 3D7 com IC50 de 15 e 10 μg/ml, respectivamente. Ao contrário e de maneira satisfatória, os A. de Hantzsch demonstraram uma baixa citotoxicidade em comparação às formulações de aldiminas. A ação leishmanicida em promastigotas de L. infantum, cepa (OP46), dos diferentes compostos ocorreu logo após as 24 de tratamento com valores de redução inferiores a 25% da viabilidade, sendo mais evidenciada, principalmente no tempo de 72 horas de contato com as aldiminas (3H8 e 3G2) e com os a. Hantzsch (8B5 e 8B6) a viabilidade das promastigotas foi reduzida acima de 50%. Para a avaliação in vitro da atividade leishmanicida em amastigotas do parasito foram empregados macrófagos caninos DH82 infectados com promastigotas de L. infantum (OP46) e tratados com os diferentes compostos químicos por 24, 48 e 72 horas, sendo avaliado por análise microscópica bem como por citometria de fluxo empregando a L. infantum cepa (OP46) transfectada com o gene repórter GFP e os resultados encontrados foram semelhantes entre as duas metodologias empregadas (microscopia e citometria de fluxo). De um modo geral foi observado redução no percentual de infecção principalmente após 48 horas de tratamento para os compostos testados. No grupo das aldiminas, os compostos 3H8, 3H9 e 3D7 apresentaram reduções maiores na taxa de infecção dos macrófagos, chegando a porcentagens de redução próximas ao controle positivo tratado com Anfotericina B. Nos compostos do grupo de a. de Hantzsch destacam-se os compostos 8A2, 8B5 e 8B6, em que principalmente o 8B6 mostrou redução significativa no percentual de infecção em relação ao grupo controle em ambos os testes (microscopia e citometria de fluxo) em todos os tempos de avaliação (24, 48 e 72 horas). Os resultados in vitro demonstram à baixa citotoxicidade e satisfatória atividade leishmanicida tanto em promastigotas quanto em amastigotas de L. infantum de alguns dos compostos químicos de aldiminas (3H7 e 3D7) e a. de Hantzsch (8A4 e 8B6) testados. O conjunto de dados obtidos sugere que os compostos aqui avaliados possuem o potencial leishmanicida e merecem ser considerados bons candidatos para prosseguirem em estudos de quimioterapia experimental in vivo para Leishmaniose Visceral.Item Biomarcadores de resistência e suscetibilidade à leishmaniose visceral em cães naturalmente infectados por Leishmania (Leishmania) infantum provenientes de área endêmica.(2013) Leal, Gleisiane Gomes de Almeida; Reis, Alexandre BarbosaA leishmaniose visceral (LV) tem grande impacto na saúde pública e cães são considerados os principais reservatórios domésticos do parasito. Estudos longitudinais em área endêmica tem demonstrado que a história natural da LV canina (LVC), pode manifestar-se num amplo espectro clínico, desde infecção assintomática até a forma sintomática. Nos últimos anos tem sido observado que cães assintomáticos e soronegativos podem apresentar-se PCR positivo e, estes animais são classificados como CA-I. Interessantemente estes cães apresentam um perfil de resposta imune diferenciado em comparação aos assintomáticos soropositivos (CA-II). Neste contexto, a busca de biomarcadores de progressão clínica é essencial para uma melhor compreensão dos mecanismos imunológicos associados a um perfil de resistência e/ou suscetibilidade na LVC. Neste trabalho, 159 cães de área endêmica, naturalmente infectados por L. infantum, foram distribuídos em quatro grupos de acordo com a forma clínica e os resultados do diagnóstico sorológico e molecular: (i) cães assintomáticos soronegativos/PCR+ para L. infantum (CA-I); (ii) cães assintomáticos soropositivos (CA-II); (iii) cães sintomáticos soropositivos (CS) e (iv) grupo controle (CN) cães sem sinais clínicos com resultados sorológicos e moleculares negativos. Além dos parâmetros hematológicos, uma análise detalhada da resposta celular, através da citometria de fluxo, no contexto ex vivo, foi realizada. Linfócitos T (CD5+, CD4+ e CD8+), células B (CD21+) e monócitos (CD14+) circulantes foram os fenótipos celulares investigados. Adicionalmente, foram realizados estudos in vitro empregando-se biomarcadores de resistência e suscetibilidade para a LVC, relacionados à produção intracitoplasmática de IFN- e IL-4+ por neutrófilos, eosinófilos e linfócitos T (CD4+ e CD8+). Nossos resultados confirmam que a progressão da doença induz anemia, caracterizada pela redução de hemácias, hemoglobina e hematócrito. Já na série branca, foi observado aumento na população de neutrófilos bastonetes e redução de eosinófilos, monócitos e linfócitos. A investigação da resposta imune, baseada no perfil imunofenotípico de células mononucleares do sangue periférico (CMSP), mostrou uma redução no número absoluto de linfócitos T CD5+, e suas subpopulações (CD4+ e CD8+), bem como uma queda no número dos linfócitos B CD21+ e monócitos CD14+ nos animais soropositivos (CA-II e CS). Neutrófilos quando estimulados com antígeno solúvel de L. infantum (ASLi), aumentaram a síntese de IFN-γ+ nos grupos CA-II e CS e diminuíram a produção de IL-4+ no grupo CA-I. Já nos grupos CA-II e CS, as subpopulações de linfócitos T (CD4+ e CD8+), tanto na cultura controle quanto na estimulada com ASLi, também apresentaram uma maior síntese de IFN-γ+ e IL-4+. Estes resultados sugerem que os animais dos grupos CA-II e CS apresentam um perfil imunológico misto (Tipo 1 e 2). Por outro lado, os animais do grupo CA-I não diferem dos animais do grupo CN conferindo a este grupo um perfil de resistência, uma vez que não ocorre queda em nenhuma das populações avaliadas, bem como não há ativação do Tipo 2 com produção de IL-4+. Já os animais do grupo CA-II e principalmente do grupo CS apresentam uma imunossupressão, que acomete tanto o compartimento T como B, além de queda de monócitos circulantes, concomitante a presença de IFN-γ+ e IL-4+ produzidas por neutrófilos e linfócitos T tornando-os incapazes de controlar a replicação parasitária.Item Canine visceral leishmaniasis : incidence and risk factors for infection in a cohort study in Brazil.(2013) Vital, Wendel Coura; Reis, Alexandre Barbosa; Reis, Levi Eduardo Soares; Braga, Samuel Leôncio; Roatt, Bruno Mendes; Soares, Rodrigo Dian de Oliveira Aguiar; Marques, Marcos José; Veloso, Vanja Maria; Carneiro, MariângelaZoonotic visceral leishmaniasis in Brazil is caused by Leishmania infantum parasites andis transmitted by sand flies of the Phlebotominae family. Dogs are the main urban reser-voirs and represent the major source of contagion for the vectors. Studies have shown thatmost infected dogs are polymerase chain reaction-positive months before seroconversion.Herein, we describe a cohort study designed to identify the incidence of and risk factorsfor L. infantum infection as detected by polymerase chain reaction-restriction fragmentlength polymorphism. To determine the risk factors for infection, we conducted a base-line canine survey (n = 1443) from which dogs were selected for the cohort study (n = 282)involving three evaluations over the course of a 26-month follow-up period. Serology,molecular tests, and a structured questionnaire were used. The risk factors for infectionwere identified by means of the Cox regression model. The overall infection incidencewas 5.8 per 100 dog-months (95% confidence interval 5.1–6.5). Increased risk of infec-tion was associated with the presence of previous cases of canine visceral leishmaniasis inthe domiciles (hazard ratio [HR] 1.4; 95% confidence interval [CI] 1.1–1.8) and unplasteredhouse walls (HR 3.6; 95% CI 1.6–8.1). These risk factors suggest that insecticide spraying incracks and crevices in unplastered walls can reduce biting rates within and around homes.Furthermore, our results demonstrate that the Visceral Leishmaniasis Control and Surveil-lance Program should adopt environmental management measures in homes with previouscases of canine visceral leishmaniasis, because these homes are more likely to maintain thetransmission cycle.