Navegando por Autor "Castro, Ieso de Miranda"

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    Adhesion on yeast cell surface as a trapping mechanism of pathogenic bacteria by Saccharomyces probiotics.
    (2012) Tiago, Fabiana da Conceição Pereira; Martins, Flaviano dos Santos; Souza, Éricka Lorenna de Sales e; Pimenta, Paulo Filemon Paolucci; Araújo, Helena Rocha Corrêa de; Castro, Ieso de Miranda; Brandão, Rogélio Lopes; Nicoli, Jacques Robert
    Recently, much attention has been given to the use of probiotics as an adjuvant for the prevention or treatment of gastrointestinal pathology. The great advantage of therapy with probiotics is that they have few side effects such as selection of resistant bacteria or disturbance of the intestinal microbiota, which occur when antibiotics are used. Adhesion of pathogenic bacteria onto the surface of probiotics instead of onto intestinal receptors could explain part of the probiotic effect. Thus, this study evaluated the adhesion of pathogenic bacteria onto the cell wall of Saccharomyces boulardii and Saccharomyces cerevisiae strains UFMG 905, W303 and BY4741. To understand the mechanism of adhesion of pathogens to yeast, cell-wall mutants of the parental strain of Saccharomyces cerevisiae BY4741 were used because of the difficulty of mutating polyploid yeast, as is the case for Saccharomyces cerevisiae and Saccharomyces boulardii. The tests of adhesion showed that, among 11 enteropathogenic bacteria tested, only Escherichia coli, Salmonella Typhimurium and Salmonella Typhi adhered to the surface of Saccharomyces boulardii, Saccharomyces cerevisiae UFMG 905 and Saccharomyces cerevisiae BY4741. The presence of mannose, and to some extent bile salts, inhibited this adhesion, which was not dependent on yeast viability. Among 44 cell-wall mutants of Saccharomyces cerevisiae BY4741, five lost the ability to fix the bacteria. Electron microscopy showed that the phenomenon of yeast–bacteria adhesion occurred both in vitro and in vivo (in the digestive tract of dixenic mice). In conclusion, some pathogenic bacteria were captured on the surface of Saccharomyces boulardii, Saccharomyces cerevisiae UFMG 905 and Saccharomyces cerevisiae BY4741, thus preventing their adhesion to specific receptors on the intestinal epithelium and their subsequent invasion of the host.
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    Análise bioinformática de transcritos da glândula de veneno da aranha – marrom Loxosceles intermedia e construção de baculovírus recombinantes como vetores de toxinas inseticidas.
    (Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto., 2005) Castro, Cibele Soares de; Castro, Ieso de Miranda
    Neste trabalho, objetivando a caracterização molecular de transcritos da glândula de veneno da aranha-marrom Loxosceles intermedia para a ampliação do banco de dados de toxinas, 268 seqüências foram agrupadas em 136 singlets e 33 consensos. Estas seqüências foram submetidas à anotação gênica para que fossem identificadas por meio de buscas de similaridade contra diferentes bancos de dados. Em seguida, foram classificadas em categorias funcionais, analisadas quanto a sua função biológica e, quando possível, modeladas por homologia para que verificássemos sua provável estrutura tridimensional. Além disso, a fim de produzir bioinseticidas de alta eficiência e especificidade, trabalhamos com toxinas de atividade letal para insetos de importância agrícola. Recentemente, a partir da purificação do veneno bruto de L. intermedia e da construção de uma biblioteca de cDNA das glândulas de veneno desta aranha, nosso grupo caracterizou toxinas com forte ação inseticida em larvas de Spodoptera frugiperda, a lagarta-do-cartucho do milho. Devido às dificuldades para se obter do veneno bruto as toxinas identificadas por biologia molecular, o uso de sistemas de expressão heterólogos torna-se necessário tanto para o estudo dos genes isolados dessas toxinas quanto para a sua obtenção em grandes quantidades. Um dos sistemas heterólogos de controle a pragas mais estudados em nível nacional e internacional é aquele que utiliza baculovírus no combate a diversas pragas agrícolas. O sistema baculovírus supera em vários aspectos os sistemas tradicionais de inseticidas químicos, sendo considerado por diversos autores como seguro ao meio ambiente e ao homem e, também, apresentando potencialmente um custo final por hectare menor do que o dos inseticidas químicos. Assim, realizamos - através da subclonagem em vetores de transferência do sistema de expressão baculovírus - a inserção dos genes das toxinas inseticidas LiTx1, LiTx2 e LiD1 (previamente identificadas a partir da glândula de veneno de L. intermedia) ao genoma do baculovírus AcMNPV. O sucesso da construção dos vírus recombinantes foi verificado após infecção de células de inseto e também por PCR. A expressão das toxinas LiTx1, LiTx2 e LiD1 foi verificada por RT-PCR, SDS-PAGE e Western Blotting. Bioensaios com os vírus recombinantes LiTx1 e LiTx2 em larvas de S. frugiperda demonstraram sua eficácia inseticida, com diminuição do tempo de vida desta lagarta, quando comparada aos vírus selvagens. Acreditamos que os baculovírus recombinantes aqui gerados poderão permitir a expressão em larga escala das toxinas LiTx1, LiTx2 e LiD1 de L. intermedia. Isso possibilitará a realização de estudos de caracterização dessas toxinas inseticidas quanto aos seus mecanismos de ação e permitirá também sua utilização como ferramentas na pesquisa básica para estudos de canais iônicos e outros processos fisiológicos.
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    Atividade antiangiogênica de inibidores de tripsina.
    (2015) Vieira, André Francisco de Castro; Andrade, Milton Hércules Guerra de; Andrade, Milton Hércules Guerra de; Castro, Ieso de Miranda; Cardoso, Leonardo Máximo
    Os inibidores Bowman-Birk, comumente chamados de BBI, são moléculas proteicas caracterizadas pela presença de dois domínios independentes, capazes de inibir serino-proteases. Embora os mecanismos de atividade biológica dessas moléculas não estejam totalmente elucidados, o interesse por essa classe de inibidores está relacionado com a descoberta de que o BBI pode atuar como agente preventivo do câncer. A capacidade do BBI de prevenir a carcinogênese tem sido estudada extensivamente, tanto em sua forma purificada quanto na forma de extrato proteico de soja enriquecido de BBI, chamado de BBI concentrado (BBIC). Parte do efeito antitumoral pode estar relacionada a uma possível atividade anti-angiogênica, uma vez que proteases que degradam a matriz extracelular podem ter atividade reduzida na presença de inibidores de tripsina. Esse trabalho teve como proposta a avaliação da atividade anti-angiogênica de inibidores de tripsina e domínios sintéticos relacionados ao BBI. Nesse sentido foram avaliados os peptídeos inibidores de tripsina e quimotripsina, sintetizados pelo nosso grupo de pesquisa utilizando-se o protocolo de síntese em fase sólida estabelecido por Merrifield (1963), o BBI purificado através de cromatografia de troca iônica, o inibidor de semente de abóbora CMTI purificado pelo método de cromatografia de afinidade e pentamidina. O inibidor BBI quando purificado em cromatografia de troca iônica demonstrou alta capacidade anti-angiogênica nas doses de 7000 até 70 pmols, enquanto quando purificado em cromatografia de afinidade ocorre à perda de praticamente toda sua atividade antitripsina e antiangiogênica, demonstrando a importância da integridade desse domínio na atividade. Os peptídeos sintéticos também foram ativos entre as doses de 7000 a 700 pmols, sendo a maior atividade observada para o peptídeo inibidor de tripsina. O inibidor de abórora purificado em cromatografia de afinidade também apresentou resposta anti-angiogênica nas concentrações de 7000 a 700 pmols em intensidade semelhante ao inibidor de tripsina sintético. A atividade ani-angiogênica associada à inibição de tripsina promovida pelos inibidores naturais e análogos gerou uma resposta máxima de 40% de redução da angiogênese. Entretanto, a pentamidina apresentou-se ativa entre doses de 7000 a 7 pmols com uma redução de até 80% na angiogênese, possivelmente, pelo fato de apresentar uma atividade antiproliferativa além da inibição de proteases. Esses resultados reforçam as evidências que inibidores de tripsina são dotados de atividade anti-angiogênica e que inibidores proteicos com propriedades antitumorais, como o BBI, podem exercer em parte, sua ação mediante a inibição da angiogênese.
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    Avaliação proteômica e caracterização do potencial angiogênico do peptídeo PR-11 e análogos.
    (2016) Breguez, Gustavo Silveira; Andrade, Milton Hércules Guerra de; Borges, William de Castro; Andrade, Milton Hércules Guerra de; Castro, Ieso de Miranda; Cardoso, Leonardo Máximo; Borges, Marcia Helena; Silva, Nilson Penha
    O proteassoma tem sido considerado um potencial alvo farmacológico devido ao seu envolvimento em processos vitais relacionados à proteólise celular, sendo a mais importante entre as vias de degradação. A literatura demonstra que estruturas análogas ao peptídeo PR-11 (RRRPRPPYLPR), que corresponde aos 11 primeiros aminoácidos da porção N-terminal do peptídeo natural PR-39, apresentam uma forte inibição sobre o proteassoma 20S. Inicialmente descoberto por suas propriedades antimicrobianas, os peptídeos desta classe desempenham importantes efeitos anti-inflamatórios e angiogênicos. Apesar da ampla atividade biológica, os estudos moleculares são predominantemente limitados à inibição do proteassoma por estes peptídeos. Dessa forma, este trabalho teve como principais objetivos: avaliar o proteoma de culturas de fibroblastos expostas ao PR-11; identificar possíveis alvos desse peptídeo por sua imobilização em coluna de afinidade e caracterizar o perfil angiogênico do PR-11 e moléculas análogas por meio de implantes subcutâneos de esponjas em camundongos. Os peptídeos PR-11, F12 e C8C15 foram sintetizados empregando-se a estratégia Fmoc em fase sólida, purificados em sistema HPLC e identificados por espectrometria de massas. A estratégia shotgun label-free foi utilizada para avaliar as alterações proteômicas causadas pela exposição de culturas de fibroblastos ao PR-11 a 1 μM durante 2, 6 e 10 horas. Esta abordagem revelou que mais da metade das proteínas diferencialmente expressas identificadas estão relacionadas à sinalização celular, transcrição e tradução. Proteínas diretamente associadas à angiogênese pela regulação ou interação com o HIF-1α foram significativamente alteradas. Além disso, ao menos três proteínas diferencialmente expressas da via do NF-κB relacionam-se a uma resposta anti-inflamatória. Em paralelo, a interação do PR-11 imobilizado com extrato solúvel de fígado de ratos permitiu a identificação de novos ligantes ao peptídeo, destacando-se a gC1qR. Esta proteína está envolvida na internalização celular do peptídeo CGKRK, o qual assemelha-se ao segmento N-terminal do PR-11. Nossos resultados apresentam evidências preliminares de que a proteína gC1qR possa mediar a internalização celular do PR-11. De modo geral, a avaliação histológica das esponjas dos animais tratados com os peptídeos PR-11, F12 e C8C15 demonstra um aumento do perfil proliferativo e maturação do processo angiogênico. Por fim, os dados obtidos neste trabalho apresentam importantes informações para a elucidação dos mecanismos moleculares envolvidos nas atividades biológicas promovidas pelo PR-11 e moléculas similares.
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    Biochemical and molecular characterization of Saccharomyces cerevisiae strains obtained from sugar-cane juice fermentations and their impact in cachaça production.
    (2008) Oliveira, Valdinéia Aparecida de; Vicente, Maristela de Araújo; Fietto, Luciano Gomes; Castro, Ieso de Miranda; Coutrim, Maurício Xavier; Schüller, Dorit; Alves, Henrique; Casal, Margarida; Santos, Juliana de Oliveira; Araújo, Leandro Dias; Silva, Paulo Henrique Alves da; Brandão, Rogélio Lopes
    Saccharomyces cerevisiae strains from different regions of Minas Gerais, Brazil, were isolated and characterized aiming at the selection of starter yeasts to be used in the production of cachac¸a, the Brazilian sugar cane spirit. The methodology established took into account the screening for biochemical traits desirable in a yeast cachac¸a producer, such as no H2S production, high tolerance to ethanol and high temperatures, high fermentative capacity, and the abilities to flocculate and to produce mycocins. Furthermore, the yeasts were exposed to drugs such as 5,5 ,5 -trifluor-D,L-leucine and cerulenin to isolate those that potentially overproduce higher alcohols and esters. The utilization of a random amplified polymorphic DNA-PCR method with primers based on intron splicing sites flanking regions of the COX1 gene, as well as microsatellite analysis, was not sufficient to achieve good differentiation among selected strains. In contrast, karyotype analysis allowed a clear distinction among all strains. Two selected strains were experimentally evaluated as cachac¸a producers. The results suggest that the selection of strains as fermentation starters requires the combined use of biochemical and molecular criteria to ensure the isolation and identification of strains with potential characteristics to produce cachac¸a with a higher quality standard.
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    Bioleaching of zinc and nickel from silicates using Aspergillus niger cultures.
    (2000) Castro, Ieso de Miranda; Fietto, Juliana Lopes Rangel; Vieira, Reinaldo Xisto; Trópia, Maria José Magalhães; Campos, Lígia Maria Moreira de; Paniago, Eucler Bento; Brandão, Rogélio Lopes
    In this work, we investigated the role of bacteria from the genera Bacillus and Pseudomonas and fungi from the genera Aspergillus and Penicillium in the leaching process of two different silicates _calamine and garnierite.. Since the results obtained with A. niger were better than those with different bacteria, a more detailed investigation of the leaching process with this microorganism was conducted. Moreover, although it is clear that the citric acid generated by fungi could be an important leaching agent acting in the solubilization of the used silicates, other products of metabolism could be involved. Related to this, the results obtained with chemical leaching using low concentrations of citric acid _lower than 10 mM. showed, for both calamine and garnierite, that the respective dissolution of zinc and nickel was much lower when compared to those processes in which cultures or supernatant liquor of A. niger cultures were used and in which the maximum concentration of citric acid was 8 mM. The results obtained also suggest that the type of mineral _andror the metal present in it. presents a different susceptibility to the bioleaching process and also demonstrate that depending of the situation, the presence of the fungi cells seem to improve the leaching process. From a practical point of view, the high yield rate of extracting metals from silicates obtained by using for example, supernatant liquors of A. niger cultures, is noteworthy. This bioleaching process present two advantages as compared to conventional chemical leaching processes: _a. the very low concentrations of organic compounds present in such a situation represent a lower ecological risk; and _b. even with a lower final yield, the economical cost of a such process. Both characteristics could facilitate its industrial application.
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    Biotechnological potential of yeast isolates from cachaça : the Brazilian spirit.
    (2015) Conceição, Luís Eduardo Fernandes Rodrigues da; Saraiva, Margarete Alice Fontes; Diniz, Raphael Hermano Santos; Oliveira, Juliana; Barbosa, Gustavo Dimas; Alvarez, Florencia; Correa, Lygia Fátima da Mata; Mezadri, Hygor; Coutrim, Maurício Xavier; Afonso, Robson José de Cássia Franco; Lucas, Cândida Manuel Ribeiro Simões; Castro, Ieso de Miranda; Brandão, Rogélio Lopes
    This study identified phenotypic traits appropriate for biotechnological applications of 118 yeasts isolated from cachaça distilleries. Different properties were verified: capacity to use alternative carbon sources; ability to tolerate high concentrations of sucrose, ethanol, methanol, aluminum and zinc as well as different pH values and foam production. Pichia guilliermondii and Pichia anomala strains were identified as the most promising ones for application in the second-generation biofuel industry, showing ability to grow on high glycerol concentrations. Other isolates, identified as Saccharomyces cerevisiae, produced bioethanol comparable to the industrial strains, and were therefore ideal for use in the first-generation ethanol industry. Some of these strains also showed high resistance to aluminum, as observed in sugarcane juice, and to intercycle washings with diluted sulphuric acid, as performed in the industrial bioethanol production process. In summary, yeast isolates from cachaça distilleries displayed robustness and phenotypic plasticity, which makes them interesting for biotechnological applications.
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    Cachaça yeast strains : alternative starters to produce beer and bioethanol.
    (2018) Araújo, Thalita Macedo; Souza, Magalhaes Teixeira de; Diniz, Raphael Hermano Santos; Yamakawa, Celina Kiyomi; Soares, Lauren Bergmann; Lenczak, Jaciane Lutz; Oliveira, Juliana Velasco de Castro; Goldman, Gustavo Henrique; Barbosa, Edilene Alves; Campos, Anna Clara Silva; Castro, Ieso de Miranda; Brandão, Rogélio Lopes
    This work was performed to verify the potential of yeast strains isolated from cachaça distilleries for two specific biotechnological applications: beer and bioethanol production. In the beer production, the strains were tested for characteristics required in brewery practices, such as: capacity to ferment maltose and maltotriose, ability to grow at lowest temperatures, low H2S production, and flocculation profile. Among the strains tested, two of them showed appropriate characteristics to produce two different beer styles: lager and ale. Moreover, both strains were tested for cachaça production and the results confirmed the capacity of these strains to improve the quality of cachaça. In the bioethanol production, the fermentation process was performed similarly to that used by bioethanol industries: recycling of yeast biomass in the fermentative process with sulfuric acid washings (pH 2.0). The production of ethanol, glycerol, organic acids, dry cell weight, carbohydrate consumption, and cellular viability were analyzed. One strain presented fermentative parameters similar to PE2, industrial/commercial strain, with equivalent ethanol yields and cellular viability during all fermentative cycles. This work demonstrates that cachaça distilleries seem to be an interesting environment to select new yeast strains to be used in biotechnology applications as beer and bioethanol production.
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    Calcium signaling and sugar-induced activation of plasma membrane H+-ATPase in Saccharomyces cerevisiae cells.
    (2006) Trópia, Maria José Magalhães; Cardoso, Anamaria de Souza; Tisi, Renata; Fietto, Luciano Gomes; Fietto, Juliana Lopes Rangel; Martegani, Enzo; Castro, Ieso de Miranda; Brandão, Rogélio Lopes
    In this work, we show that glucose-induced activation of plasma membrane H+-ATPase from Saccharomyces cerevisiae is strongly dependent on calcium metabolism and that the glucose sensor Snf3p works in a parallel way with the G protein Gpa2p in the control of the pathway. The role of Snf3p is played by the Snf3p C-terminal tail, since in a strain with the deletion of the SNF3 gene, but also expressing a chimera protein formed by Hxt1p (a glucose transporter) and the Snf3p C-terminal tail, a normal glucose-activation process can be observed. We present evidences indicating that Snf3p would be the sensor for the internal signal (phosphorylated sugars) of this pathway that would connect calcium signaling and activation of the plasma membrane ATPase. We also show that Snf3p could be involved in the control of Pmc1p activity that would regulate the calcium availability in the cytosol.
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    Carbonyl cyanidem - chlorophenylhydrazone induced calcium signaling and activation of plasma membrane H1-ATPase in the yeast Saccharomyces cerevisiae.
    (2008) Pereira, Michele B. P.; Tisi, Renata; Fietto, Luciano Gomes; Cardoso, Anamaria de Souza; França, Mônica M.; Carvalho, Fernanda Machado de; Trópia, Maria José Magalhães; Martegani, Enzo; Castro, Ieso de Miranda; Brandão, Rogélio Lopes
    The plasma membrane H1-ATPase from Saccharomyces cerevisiae is an enzyme that plays a very important role in the yeast physiology. The addition of protonophores, such as 2,4-dinitrophenol (DNP) and carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone (CCCP), also triggers a clear in vivo activation of this enzyme. Here, we demonstrate that CCCP-induced activation of the plasma membrane H1-ATPase shares some similarities with the sugar-induced activation of the enzyme. Phospholipase C and protein kinase C activities are essential for this activation process while Gpa2p, a G protein involved in the glucose-induced activation of the ATPase, is not required. CCCP also induces a phospholipase Cdependent increase in intracellular calcium. Moreover, we show that the availability of extracellular calcium is required for CCCP stimulation of H1-ATPase, suggesting a possible connection between calcium signaling and activation of ATPase.
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    Clonagem do cDNA codificante para a toxina madura LTx5 da aranha Lasiodora sp no vetor pYES2.1/V5-His-TOPO® e expressão da proteína recombinante.
    (Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto., 2009) Batista, Thiago Mafra; Castro, Ieso de Miranda
    O estudo de toxinas presentes em venenos de animais vem apresentando crescimento contínuo. O veneno da aranha do gênero Lasiodora sp, popularmente conhecida como caranguejeira, ainda é pouco explorado. Neste trabalho, nós sub clonamos a sequencia codificante para a toxina madura LTx5 no vetor de expressão pYES2.1/V5-HIS-TOPO® (Invitrogen) em fusão com um V5 epitope e uma cauda de histidina. A LTx5 foi previamente identificada através da varredura de uma biblioteca de cDNA da glândula de veneno da aranha Lasiodora sp. Após confirmação da clonagem por PCR de colônias e cortes do DNA plasmidial com endonucleases de restrição, realizamos o sequenciamento de ambas as fitas do DNA e verificamos que o inserto foi inserido no frame correto. A expressão da proteína recombinante foi realizada utilizando células de Saccharomyces cerevisiae W303-1A. Alcançamos uma melhor expressão da proteína recombinante LTx5 quando as células foram pré-cultivadas em meio contendo rafinose, e induzidas em meio contendo 4% de galactose (p/v). A imunodetecção da proteína recombinante LTx5 contendo a cauda de histidina utilizando anticorpo monoclonal anti His-Tag só foi possível em ensaios de Dot Blot. O tratamento no qual as proteínas são submetidas em um ensaio de Western Blot parece interferir na ligação antígenoanticorpo. Não alcançamos sucesso nos procedimentos de purificação testados devido ao baixo rendimento de expressão da proteína. A presença de códons raros na sequencia codificante para a toxina LTx5 e a toxicidade da molécula para as células de Saccharomyces cerevisiae parecem afetar negativamente o rendimento da expressão da proteína. Sugerimos que os estudos futuros com esta toxina sejam realizados utilizando um sistema mais eficiente para a expressão da proteína.
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    Clonagem e expressão da sequência codificante para o peptídeo maduro LTx4 da aranha Lasiodora sp em sistema pET21b.
    (Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto., 2010) Pimentel, Filippe Gadioli; Castro, Ieso de Miranda
    Peptídeos neurotóxicos encontrados em venenos animais têm despertado um grande interesse de pesquisadores. A possibilidade de utilizá-los como ferramentas moleculares para estudos em canais iônicos, além do uso como bioinseticidas e/ou como biofármacos, tem impulsionado as pesquisas nessa área. Experimentos com o veneno bruto da aranha caranguejeira Lasiodora sp mostraram que o mesmo atua em canais iônicos de pequenos vertebrados e de invertebrados. Recentemente, construímos uma biblioteca de cDNA a partir dos mRNAs presentes na glândula de veneno dessa aranha. A varredura desta biblioteca, usando a técnica de ELISA, e o sequenciamento de DNA, permitiram a identificação de cinco toxinas presentes no veneno, nomeadas LTx1, LTx2, LTx3, LTx4 e LTx5. Experimentos realizados com a toxina recombinante LTx2, em células musculares BC3H1, mostraram que esse peptídeo bloqueia canais de cálcio tipo-L e inibe a recarga de Ca2+ dos estoques intracelulares. A estrutura primária do peptídeo LTx2 é muito similar a dos peptídeos LTx1 e LTx3, portanto, espera-se que essas toxinas possuam mescanismos de ação semelhantes. Por outro lado, a sequência de aminoácidos da LTx4 e da LTx5 são bem diferentes, tanto quando comparadas com a LTx1, LTx2 e LTx3, quanto entre si, o que leva a acreditar que elas possam atuar em diferentes canais e/ou ter diferentes mecanismos de ação. Neste trabalho, a sequência codificante para o peptídeo maduro LTx4 foi subclonada no vetor de expressão pET21b (Novagen). A estratégia foi inserir o gene de interesse sob o controle do promotor T7 e obter um produto expresso em fusão com uma cauda de seis histidinas. A confirmação da clonagem foi realizada através de PCR, digestão do DNA plasmidial com endonucleases de restrição e, finalmente, seqüenciamento dos DNAs extraídos dos clones positivos. A indução da expressão do peptídeo LTx4 foi realizada com a adição de 1mM de IPTG ao meio de cultura. Nos ensaios de imunodetecção utilizamos o anticorpo monclonal anti His-Tag. O peptídeo recombinante foi identificado tanto em experimentos de Western Blot como em experimentos de Dot Blot. O peptídeo recombinante foi expresso exclusivamente na forma de corpos de inclusão e em maiores quantidades após três a quatro horas de indução. O perfil protéico foi analisado em géis de poliacrilamida (Tricina-SDS). Experimentos de purificação do peptídeo encontramse em andamento.
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    Clonagem e expressão do cDNA codificante para a toxina do veneno de Lasiodora sp, LTx2, em vetor de expressão pET11a.
    (Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto., 2006) Dutra, Alexandre Augusto de Assis; Castro, Ieso de Miranda
    O veneno de cobras, escorpiões, aranhas e outros animais venenosos é uma fonte rica em toxinas. Uma característica importante de algumas toxinas é o fato de serem espécie específicas. Neste trabalho, nós realizamos a clonagem da seqüência codificante para a toxina LTx2 da aranha Lasiodora sp. no vetor de expressão pET11a. Esta toxina foi previamente identificada, através da varredura de uma biblioteca de cDNA da glândula de veneno desta aranha. A análise de similaridade, feita com o programa de alinhamento local BLAST, mostrou que esta toxina apresenta similaridade com as toxinas huwetoxina-II e huwetoxina-VII da aranha Selenocosmia huwena, bem como com as toxinas LTx1 e LTx3 da Lasiodora sp. Após a clonagem no vetor de expressão, nós sequenciamos o produto da clonagem pelo método de Sanger e verificamos que o mesmo foi inserido no frame correto. A indução da expressão da toxina recombinante foi feita usando IPTG na concentração de 0,6 mM, por 3-4 horas. Através de ensaios imunoquímicos, nós constatamos que neste sistema a proteína recombinante é expressa sobretudo na forma de corpos de inclusão. Definimos então, uma estratégia para obter a toxina solúvel renaturada. Utilizando uma solução contendo uréia na concentração de 6 M realizamos a desnaturação dos corpos de inclusão, e procedemos a renaturação da proteína recombinante através de diálise em um tampão de renaturação. A amostra foi então submetida a uma cromatografia líquida de alta pressão em coluna de fase reversa. Através de eletroforese e Western Blotting, nós observamos que a estratégia de purificação foi eficiente. Realizamos então um ensaio antimicrobiano, onde observamos que a toxina recombinante, na concentração de 400 mg/mL. inibiu o crescimento dos microrganismos Escherichia coli, Salmonella Agona e Staphylococcus epidermidis. A expressão e recuperação da proteína recombinante em maior quantidade permitirá a realização de testes em outros organismos e a realização de ensaios eletrofisiológicos.
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    Cromatografia de afinidade pelo ácido ε-aminocapróico para purificação e depleção de anticorpos em condições otimizadas para preservação estrutural e funcional.
    (2014) Neves, Leandro Xavier; Borges, William de Castro; Andrade, Milton Hércules Guerra de; Borges, William de Castro; Fonseca, Cristina Toscano; Castro, Ieso de Miranda
    Imunoglobulinas ou anticorpos são glicoproteínas produzidas pelas células B. Estas moléculas podem ser encontradas ancoradas na membrana plasmática da célula produtora ou em fluidos corporais, como sangue e líquido ascítico, na sua forma secretada. Sua estrutura tridimensional revela uma organização básica correspondente à associação das cadeias polipeptídicas leve e pesada. A capacidade de reconhecimento molecular altamente específico faz dessas moléculas poderosas ferramentas nas ciências biomédicas, sendo úteis nas pesquisas científicas, métodos de diagnóstico e imunoterapias. Anticorpos são obtidos a partir de soro de animais ou culturas celulares após rigorosas etapas de purificação, que se destinam à remoção de contaminantes comuns como vírus, pirogênios e proteínas abundantes. Particularmente, o isolamento de anticorpos utilizando cromatografia de afinidade permite sua purificação e depleção em amostras de plasma, precedendo as análises proteômicas. Embora vários procedimentos para purificação/depleção de anticorpos estejam atualmente disponíveis, algumas limitações como especificidade restrita à determinadas classes e espécies e alto custo, justificam o desenvolvimento de métodos alternativos. O objetivo deste trabalho foi a síntese de matrizes cromatográficas, utilizando ácido ε-aminocapróico (AEAC), para purificação e depleção de anticorpos. Quatro, das cinco, matrizes obtidas exibiram especificidade por anticorpos plasmáticos humanos e IgY da gema do ovo de Gallus gallus. O emprego de condições cromatográficas brandas, especialmente eluição em pH fisiológico e baixa força iônica, permitiu a recuperação de anticorpos funcionais, como revelado por Western blotting. O perfil eletroforético bidimensional, seguido da análise por espectrometria de massas, revelou uma heterogeneidade de isoformas e a purificação dos isotipos humanos IgG1,2,3,4, IgA1, IgD, IgM e IgY de Gallus gallus, com alto grau de pureza. Além disso, a imobilização do ácido ε-aminocapróico em micropartículas magnéticas constitui uma estratégia bem sucedida de depleção plasmática de anticorpos, a partir de pequenos volumes. Por último, a avaliação do desempenho das matrizes sintetizadas revelou a melhor capacidade de retenção da matriz pré-ativada NHS-AEAC (30 mg de anticorpo/g). Concluímos que o acoplamento do ácido ε-aminocapróico em suportes cromatográficos constitui uma alternativa para a purificação e depleção de anticorpos plasmáticos e IgY, revelando-se como uma nova ferramenta de interesse biotecnológico.
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    Deficiency of Pkc1 activity affects glycerol metabolism in Saccharomices cerevisiae.
    (2005) Gomes, Katia das Neves; Freitas, Suzy Magaly Alves Cabral de; Pais, Thiago Martins; Fietto, Juliana Lopes Rangel; Totola, Antonio Helvecio; Arantes, Rosa Maria Esteves; Martins, António; Lucas, Cândida Manuel Ribeiro Simões; Schuller, Dorit; Casal, Margarida; Castro, Ieso de Miranda; Fietto, Luciano Gomes; Rogelio, Lopes Brandão
    Protein kinase C is apparently involved in the control of many cellular systems: the cell wall integrity pathway, the synthesis of ribosomes, the appropriated reallocation of transcription factors under specific stress conditions and also the regulation of N-glycosylation activity. All these observations suggest the existence of additional targets not yet identified. In the context of the control of carbon metabolism, previous data had demonstrated that Pkc1p might play a central role in the control of cellular growth and metabolism in yeast. In particular, it has been suggested that it might be involved in the derepression of genes under glucose-repression by driving an appropriated subcellular localization of transcriptional factors, such as Mig1p. In this work, we show that a pkc1D mutant is unable to grow on glycerol because it cannot perform the derepression of the GUT1 gene that encodes glycerol kinase. Additionally, active transport is also partially affected. Using this phenotype, we were able to isolate a new pkc1D revertant. We also isolated two transformants identified as the nuclear exportin Msn5 and the histone deacetylase Hos2 extragenic suppressors of this mutation. Based on these results, we postulate that Pkc1p may be involved in the control of the cellular localization and/or regulation of the activity of nuclear proteins implicated in gene expression.
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    Detailed search for protein kinase(s) involved in plasma membrane H+-ATPase activity regulation of yeast cells.
    (2015) Pereira, Renata Rebeca; Castanheira, Diogo Dias; Teixeira, Janaina Aparecida; Bouillet, Leoneide Érica Maduro; Ribeiro, Erica Milena de Castro; Trópia, Maria José Magalhães; Alvarez, Florencia; Correa, Lygia Fátima da Mata; Mota, Bruno Eduardo Fernandes; Conceição, Luís Eduardo Fernandes Rodrigues da; Castro, Ieso de Miranda; Brandão, Rogélio Lopes
    This study displays a screening using yeast strains deficient in protein kinases known to exist in Saccharomyces cerevisiae. From 95 viable single mutants, 20 mutants appear to be affected in the glucose-induced extracellular acidification. The mutants that are unaffected in calcium signaling were tested for their sensitivity to hygromycin B. Furthermore, we verified whether the remaining mutants produced enzymes that are appropriately incorporated at plasma membrane. Finally, we measure the kinetic properties of the enzyme in purified plasma membranes from glucose-starved as well as glucose-fermenting cells. We confirmed the kinase Ptk2 involvement in H+−ATPase regulation (increase of affinity for ATP). However, the identification of the kinase(s) responsible for phosphorylation that leads to an increase in Vmax appears to be more complex. Complementary experiments were performed to check how those protein kinases could be related to the control of the plasma membrane H+−ATPase and/or the potential membrane. In summary, our results did not permit us to identify the protein kinase(s) involved in regulating the catalytic efficiency of the plasma membrane H+−ATPase. Therefore, our results indicate that the current regulatory model based on the phosphorylation of two different sites located in the C-terminus tail of the enzyme could be inappropriate.
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    Draft genome sequence of Wickerhamomyces anomalus LBCM1105, isolated from cachaça fermentation.
    (2020) Cunha, Aureliano Claret da; Santos, Renato Augusto Corrêa dos; Pachón, Diego Mauricio Riaño; Squina, Fábio Márcio; Oliveira, Juliana Velasco de Castro; Goldman, Gustavo Henrique; Souza, Aline Tieppo de; Gomes, Lorena Soares; Santos, Fernanda Godoy; Teixeira, Janaina Aparecida; Oliveira, Fábio Faria; Cruz, Izinara Rosse da; Castro, Ieso de Miranda; Lucas, Cândida; Brandão, Rogélio Lopes
    Wickerhamomyces anomalus LBCM1105 is a yeast isolated from cachaça distillery fermentation vats, notable for exceptional glycerol consumption ability. We report its draft genome with 20.5x in-depth coverage and around 90% extension and completeness. It harbors the sequences of proteins involved in glycerol transport and metabolism.
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    Effect of substrate and pH on the activity of proteases from Fusarium oxysporum var. lini.
    (1991) Castro, Ieso de Miranda; Lima, Angélica Alves; Paula, Carmem Aparecida de; Nicoli, Jacques Robert; Brandão, Rogélio Lopes
    The results obtained in this work suggest that both the pH (through selective inhibition) and the carbon source (through repression and acidification or alkalinization of the medium) may play an important role in the distribution of extracellular proteases in Fusarium oxysporum var. lini.
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    Effect of the trehalose levels on the screening of yeast as probiotic by in vivo and in vitro assays.
    (2008) Martins, Flaviano dos Santos; Castro, Ieso de Miranda; Rosa, Carlos Augusto; Nicoli, Jacques Robert; Neves, Maria José
    Probiotics are viable defined microorganisms (bacteria or yeasts) that exert a beneficial effect on the health of the host when ingested in adequate amounts. Screening for such biotherapeutic agents is commonly performed by in vitro assays simulating gastrointestinal environment to determine the ability to survive in the digestive tract. In the present study, the possibility of extrapolation of data obtained in in vitro assays to in vivo conditions was studied using five Saccharomyces cerevisiae strains isolated from Brazilian Atlantic rain forest. Trehalose contents and survival after exposure to a combination of physiological stresses generally found in the gastrointestinal tract of humans were determined for the five yeasts and compared to the behavior of Saccharomyces boulardii, a well-known probiotic. The results were completed with the colonization capacity of the gastrointestinal tract of gnotobiotic mice by these yeast strains. Some results obtained by in vitro assays are not confirmed by in vivo experiments, indicating that the extrapolation cannot be always done.
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    Envolvimento do íon cálcio na resposta ao estresse ácido em Saccharomyces cerevisiae.
    (2014) Almeida, Marcos Vinicius Simi; Castro, Ieso de Miranda
    Para manter sua capacidade produtiva, as células de leveduras precisam adaptar-se às mudanças ambientais que ocorrem durante o processo produtivo. A resposta a baixo pH é de interesse, pois tal exposição ocorre sob condições industriais como no tratamento ácido para redução de contaminação bacteriana antes da reciclagem celular em processos fermentativos. Semelhante à resposta a ácidos orgânicos, a resistência a ácidos inorgânicos envolve mudanças da permeabilidade de membrana, extrusão ativa de H+ e modulação da expressão gênica. O presente trabalho estudou a participação do íon cálcio na resposta ao estresse ácido na levedura Saccharomyces cerevisiae. Os resultados obtidos mostram elevação transitória dos níveis citoplasmáticos de Ca2+ desencadeada por pulso ácido e que esta mudança decorre do influxo de cálcio extracelular e da mobilização vacuolar do íon. Testes de viabilidade celular sugerem que a tolerância da S. cerevisiae a estresse ácido envolve a ativação da via de sinalização da calcineurina dependente de Ca2+/calmodulina e consequente regulação da expressão de alguns genes mediada pelo fator de transcrição Crz1p/Tcn1p. A tolerância dos mutantes nulos da via de sinalização da quinase Snf1p, responsável pela utilização de fontes alternativas de carbono, foi menor em relação à cepa parental BY4741, sugerindo a participação desta via na resposta a baixo pH. Em conjunto, os resultados mostram a importância das vias de sinalização da fosfatase calcineurina e da quinase Snf1p para a resposta da S. cerevisiae a estresse ácido.