Farmacocinética e eficácia terapêutica de lactona sesquiterpênica nanoestruturada na doença de Chagas experimental em modelo murino.

Abstract

A doença de Chagas (DCh) apesar de ser um sério problema de saúde pública na América Latina e cada vez mais constatada em países de outros continentes, ainda permanece negligenciada, pois os fármacos existentes para uso humano são ineficazes e causam graves efeitos colaterais. Os objetivos deste trabalho foram: (i) o desenvolvimento, caracterização e validação de formulações de nanocápsulas (NC) convencionais (PCL NC) e furtivas (PLA-PEG NC) contendo a lactona licnofolida (LIC) obtida de Lychnophora trichocarpha e (ii) o estudo de sua eficácia terapêutica em camundongos infectados com cepas de diferentes perfis de resistência/ susceptibilidade ao Benzonidazol e Nifurtimox (BZ e NF). O isolamento e caracterização da LIC pura foram previamente descritas por Branquinho et al. (2014 a). As NC foram produzidas para melhorar a farmacocinética da LIC, diminuir sua toxicidade, promover sua liberação controlada e melhorar sua eficácia terapêutica. As NC foram produzidas por deposição interfacial de polímero pré-formado nas concentrações de 2,0; 3,0 e 4,0 mg/mL da LIC e NC-branca. Em seguida, as LIC NC foram caracterizadas: o tamanho médio de LIC-PCL NC foi de 175,4-245,2 nm e de LIC-PLA-PEG NC de 105,2-159,2 nm. Para ambas NC e em todas as concentrações, os valores obtidos de índice de polidispersão determinados por espectroscopia de correlação de fótons foram ≤0,25. O potencial zeta determinado por anemometria por laser doppler da LIC-PCL NC foi de -42,7 a -57,1 mV e da LIC-PLA-PEG NC -30,3 a -40,1 mV. A morfologia das formulações foi determinada por microscopia de força atômica. As formulações contendo LIC foram quantificadas e validadas por CLAE-UV, conforme os requisitos estabelecidos pelo ICH, (2005). A porcentagem e eficiência de encapsulação das NC, avaliadas pela técnica de ultrafiltração/ultracentrifugação, foram de aproximadamente 100% para ambas as formulações, indicando que a LIC encontra-se associada ao núcleo oleoso da NC. Uma elevada estabilidade das formulações de LIC-PCL NC e LIC-PLA-PEG NC foi observada por um período de até seis meses. Foi desenvolvido pela primeira vez, um método bioanalítico empregando CLAE-UV, precedido de extração por precipitação de proteínas da LIC em NC contidas em amostras plasmáticas de animais tratados. O método foi validado de acordo com as especificações do FDA e ANVISA, mostrando-se adequado para ser aplicado ao monitoramento farmacocinético (PK) em modelo murino. Os principais parâmetros farmacocinéticos (pk) observados no tratamento dos camundongos com as NC foram ASC, t1/2 , Cl , TMR, . Verificou-se de maneira geral, um prolongamento da circulação plasmática, aumento da ASC e do t1/2 e uma redução do Cl da formulação LIC-PLA-PEG NC em relação à LIC-PCL NC. Os parâmetros PK da LIC livre apresentaram valores estatisticamente inferiores em relação às formulações NC. Os estudos in vivo de eficácia terapêutica foram realizados em camundongos Swiss tratados com LIC-PCL NC, LICPLA-PEG NC e BZ utilizado como fármaco de referência. O efeito de NC-LIC, LIC livre, BZ e controles foram avaliados em animais inoculados com 10.000 tripomastigotas sanguíneos (fase aguda-FA) ou 500 (fase crônicaFC) com as cepas CL, Y, Colombiana e VL-10 (estas duas últimas 100% resistente ao BZ). O tratamento foi administrado via i.v., 2,0 mg/kg/dia e oral 5,0; 8,0 e 12,0 mg/kg/dia, por 20 dias consecutivos e a eficácia terapêutica avaliada por exame de sangue a fresco, hemocultura, PCR e ELISA. Todos os protocolos revelaram atividade parcial da LIC livre e os melhores resultados terapêuticos com a formulação LIC-PLA-PEG NC em relação à LIC-PCL NC e BZ. Os animais infectados com as cepas CL, Y e Colombiana foram tratados na FA com LIC-PCL NC e LIC-PLA-PEG NC, 2,0 mg/kg/dia e BZ 50 mg/kg/dia, via i.v. Foi verificado que nos animais infectados com a cepa CL a parasitemia foi subpatente, ocorreu aumento da sobrevida e ainda 100% de cura com ambas as formulações nanoestruturadas e BZ. Em animais infectados com a cepa Y a cura foi de 62,5% com LICPCL NC, de 100% com LIC-PLA-PEG NC e de 75% com BZ. Nos animais infectados com a cepa Colombiana houve cura de 62,5% apenas com LIC-PLA-PEG NC, acompanhada de significativa redução da parasitemia e aumento da sobrevida. Nos animais infectados com a cepa Y e tratados na FA com as duas formulações de LIC NC, 5,0 mg/kg/dia e BZ 100 mg/kg/dia, via oral, foi verificado cura de 62,5% dos tratados com LIC-PLA-PEG NC e BZ e de 57,2% nos tratados com LIC-PCL NC. Nos animais infectados com a cepa Y e tratados na FC da infecção com a formulação LIC-PLA-PEG NC administrada por via i.v. e oral foram observados índices de cura de 50% e 55%, respectivamente. Este resultado foi estatisticamente superior ao observado com LIC-PCL NC que curou 33% dos animais por via i.v. e 30% por via oral, enquanto nenhum animal tratado com BZ por via i.v. e oral foi curado. Nos animais infectados com a cepa VL-10 tratados na FC com a formulação LIC-PLA-PEG NC, via oral, foi verificado cura de 87,5% dos tratados com a dose de 12,0 mg/kg/dia e de 43% dos tratados com 8,0 mg/kg/dia, enquanto os animais tratados com BZ não foram curados. Este trabalho demonstrou pioneiramente (i) a eficácia terapêutica da LIC in vivo quando livre (ii) em formulações de NC (iii), principalmente quando associada ao polímero PLA-PEG (iv), para o tratamento da DCh experimental tanto na FA (v) quanto na FC (vi) da infecção e com cepas totalmente resistentes ao BZ e NF (vii) . A formulação PLA-PEG NC alterou os parâmetros PK da LIC aumentando a sua concentração plasmática-tempo o que por consequência, aumentou sua eficácia evidenciando o grande potencial da LIC para estudos clínicos no tratamento da DCh especialmente quando associada a determinado nanocarreador.